林建城，羅新明，林娟娟

1. 莆田學院環(huán)境與生物工程學院，莆田 351100 2. 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室(莆田學院)，莆田 351100

根據幾丁質酶作用機理不同，現認為至少包含有內切幾丁質酶、外切幾丁質酶和具外切酶性質的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)等3種組分[1]。近年來，NAGase在節(jié)肢動物中的生理作用被廣泛關注。Koga等[2]從家蠶(Bombyxmori)的表皮層中獲得NAGase，研究發(fā)現，蠶表皮NAGase與其周期性的蛻皮生理以及與生活周期中蛹的形成密切相關；隨后，Buchholz[3]研究了南極磷蝦(Euphausiasuperba)的蛻皮生理與NAGase活力變化的相關性，發(fā)現在南極磷蝦蛻皮前短時間內NAGase大量合成，酶活力迅速提高，用于降解蝦幾丁質表皮；而Zou和Fingerman[4]的研究表明，招潮蟹(Ucapugilator)表皮和肝胰腺中NAGase的合成受類固醇蛻皮激素調控，NAGase活力變化與其周期性蛻皮之間存在密切相關。同樣，樸順金等[5]研究了不同養(yǎng)殖期凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)外殼膜NAGase的性質，發(fā)現在蝦幼體和生殖期時，由于蛻殼頻繁，蝦外殼膜NAGase比活力會迅速升高，從而進一步闡述了NAGase在節(jié)肢動物周期性蛻皮中的生理功能。

中國鱟(Tachypleustridentatus)屬于節(jié)肢動物門肢口綱劍尾目，已成為了瀕危物種，是國家二級保護動物，人類過度捕殺是導致其數量劇減的主要原因，另一個原因是工業(yè)生產產生的一些重金屬由于過量排放嚴重破壞了海水系統(tǒng)，鱟賴以生存的海域環(huán)境受到嚴重污染，擾亂了鱟的正常生理活動與物質代謝。梁君榮等[6]的研究表明，Zn、Pb、Cu和Cd等重金屬對中國鱟的胚胎發(fā)育有不同的影響，當這些重金屬離子的濃度超過漁業(yè)水域水質標準濃度8倍時，Cd2+和Cu2+對鱟的胚胎發(fā)育無明顯影響，但Zn2+和Pb2+會使鱟胚胎發(fā)育中卵徑變小，發(fā)育速度下降，對鱟胚胎發(fā)育的毒性從大到小為Pb2+>Zn2+>Cu2+≈Cd2+。此后，研究發(fā)現，金屬離子對節(jié)肢動物特別是甲殼動物幾丁質酶的生理生化有重要影響。張偉妮等[7]的研究表明，Ag+、Pb2+、Zn2+和Hg2+等4種重金屬離子對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii) NAGase酶活力均有不同程度的可逆抑制作用，其中Ag+和Pb2+對酶還有先激活后抑制的作用；還有研究發(fā)現，Zn2+對鋸緣青蟹內臟(Scyllaserrata)[8]NAGase會產生可逆抑制作用，Zn2+的存在會降低酶的溫度穩(wěn)定性；而Hg2+對凡鈉對蝦(Penaeusvannamei)[9]內臟NAGase又有較強的不可逆的抑制作用。這說明環(huán)境中的金屬離子對節(jié)肢動物中與蛻皮生理相關的幾丁質酶產生重要影響。在中國鱟的胚胎發(fā)育到性成熟期間，至少需經19次蛻皮，鱟的蛻皮生理直接關系到鱟的正常生長與發(fā)育。Hg2+和Pb2+是環(huán)境中重金屬離子污染物的重要組成份，直接影響到水生動物的生理代謝并引起慢性毒性效應[10-11]，但它們對中國鱟幾丁質酶的影響，目前還未有深入研究。筆者課題組之前已對中國鱟內臟NAGase進行了分離純化[12]，現繼續(xù)探討Hg2+和Pb2+這2種重金屬離子對中國鱟NAGase的影響，研究中國鱟NAGase酶活力、構象變化和效應物之間的相關性，這對揭示海洋污染物與鱟蛻皮生理之間的相關性具有重要作用，并為能更好地保護鱟資源和合理開發(fā)利用鱟資源提供一些科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

參照文獻[12]所述方法分離純化中國鱟內臟NAGase，分別通過抽提、30%和80%的飽和硫酸銨分級分離、Sephadex G-200凝膠層析以及DEAE-32離子交換層析分離，純化后獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)單一純的酶制劑，比活力為505.21 U·mg-1，酶制劑在4 ℃下經過雙蒸餾水透析后，用于Hg2+和Pb2+對NAGase影響的研究。

NAGase催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)，分析純，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成；Sephadex G-200是Pharmacia產品；纖維素DEAE-32是Whatman產品；硝基酚(pNP)、HgCl2和Pb(NO3)2等試劑均為分析純，均為上海國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 中國鱟NAGase活力測定

按文獻[12]中NAGase活力的檢測方法測定中國鱟NAGase活力。在2 mL的酶活測定體系中，包含1 mL 75 mmol·L-1HAC-NaAC緩沖液(pH 5.4)，0.2 mL 5 mmol·L-1的底物pNP-β-D-GlcNAc，0.78 mL的雙蒸餾水，20 μL酶液。在37 ℃下反應10 min，以2 mL 0.5 mol·L-1NaOH終止反應，測定A405 nm，以先加2 mL 0.5 mol·L-1NaOH、后加20 μL酶液為空白對照。以產物硝基酚(pNP)為標準物，制定標準曲線。1個酶活力單位(U)定義為：在上述條件下，每分鐘催化水解產生1 μmol·L-1pNP所需的酶量規(guī)定為1 U，酶催化活力大小以酶促反應速度(v)大小表示。

1.2.2 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響

在NAGase活力的測定體系中，在0～200 μmol·L-1范圍內加入不同濃度的HgCl2，測定加入HgCl2后NAGase的剩余酶活力；以同樣的方法，在0～50 mmol·L-1范圍內加入不同濃度的Pb(NO3)2，測定加入Pb(NO3)2后NAGase的剩余酶活力。以未添加金屬離子的對照組酶活力為100%，其他各試驗組以相對酶活力(%)表示。

1.2.3 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機理

在2 mL NAGase活力的測定體系中，底物pNP-β-D-GlcNAc濃度為5 mmol·L-1，改變NAGase濃度(1.7、3.4、5.1、6.8和8.5 μg·mL-1)，分別測定在0、10、20、30和40 μmol·L-1等5種不同濃度HgCl2作用下NAGase的催化活力；同樣測定在0、15、20、25和30 mmol·L-1等5種不同濃度Pb(NO3)2作用下NAGase的催化活力，并設立各自對照組，以酶濃度對酶活力作圖，分別判斷Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機理。

1.2.4 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用類型

在NAGase活力的測定體系中，改變pNP-β-D-GlcNAc底物濃度(0.15、0.20、0.25、0.33和0.50 mmol·L-1)，分別測定在0、10、20、30和40 μmol·L-1等5種不同濃度HgCl2作用下NAGase的催化活力；同樣分別測定在0、15、20、25和30 mmol·L-1等5種不同濃度Pb(NO3)2作用下的NAGase催化活力。以Lineweaver-Burk雙倒數作圖，確定中國鱟NAGase的米氏常數Km和最大反應速度Vm以及在HgCl2和Pb(NO3)2作用下的表觀米氏常數Kmapp和最大反應速度Vmapp，分別判斷HgCl2和Pb(NO3)2對NAGase抑制作用的類型，并求解各自抑制常數KI。

1.2.5 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase熒光發(fā)射光譜的影響

Hg2+對中國鱟NAGase熒光發(fā)射光譜影響的測定，采用的NAGase濃度為5.72 μg·mL-1，HgCl2濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1；而Pb2+對NAGase熒光發(fā)射光譜影響的測定，采用的NAGase濃度為8.59 μg·mL-1，Pb(NO3)2濃度分別為0、50、75、100、200、400和500 μmol·L-1，酶在2 mL 37.5 mmol·L-1HAC-NaAC緩沖液(pH 5.4)中分別與不同濃度的HgCl2和Pb(NO3)2混合，靜置30 min(37 ℃)，后用美國Cary Eclipse熒光分光光度計掃描，在內源熒光激發(fā)光譜波長為232.2 nm的條件下，測定NAGase的內源熒光發(fā)射光譜。

2 結果(Results)

2.1 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響

由圖1可知，Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活性均有不同程度的抑制作用，抑制作用均呈濃度效應，Hg2+比Pb2+對NAGase的抑制作用強，200 μmol·L-1Hg2+可抑制酶活力97.0%，而30 mmol·L-1Pb2+可使酶活力下降53.6%。這說明Hg2+和Pb2+這2種重金屬離子對中國鱟NAGase均有明顯抑制作用，Hg2+對NAGase的抑制作用強于Pb2+。

圖1 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響Fig. 1 Effects of Hg2+ and Pb2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatus

2.2 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機理

在5個不同酶濃度下，研究了Hg2+對中國鱟NAGase的影響效應，結果如圖2所示，以NAGase催化反應速度(v)對酶濃度作圖，得到一組通過原點的直線，隨Hg2+濃度逐漸升高，各直線斜率不斷降低，說明Hg2+對NAGase的抑制作用是屬于可逆抑制作用。同樣，研究了Pb2+對中國鱟NAGase的影響效應，以加入Pb2+后NAGas催化反應速度(v)對酶濃度作圖(圖3)，也得到一組通過原點的直線，隨Pb2+濃度升高，各直線的斜率也在降低，說明Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用也是一個可逆過程，屬于可逆抑制作用。結果表明，Hg2+和Pb2+都是通過抑制NAGase活力而降低酶的催化效率，不是通過降低反應體系中的有效酶量而使酶活力降低的[13]。

圖2 Hg2+對中國鱟NAGase抑制機理的判斷注：v為酶促反應速度；直線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 2 Determination of the inhibitory mechanism of Hg2+ on NAGase from Tachypleus tridentatusNote: v is the rate of reaction; Concentrations of Hg2+ for curves 0～4 were 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1, respectively.

圖3 Pb2+對中國鱟NAGase抑制機理的判斷注：直線0～4，Pb2+濃度分別為0、15、20、25和30 mmol·L-1。Fig. 3 Determination of the inhibitory mechanism of Pb2+ on NAGase from Tachypleus tridentatus Note: Concentrations of Pb2+ for curves 0～4 were 0, 15, 20, 25 and 30 mmol·L-1, respectively.

2.3 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用類型

通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖判斷Hg2+對中國鱟NAGase的抑制類型，結果(圖4a)表明，隨著Hg2+濃度增大，相應的5條直線的斜率也逐漸增大，這5條直線交于y軸上的一點，Hg2+對酶的抑制并不改變酶促反應的最大反應速度(Vm)，Kmapp值隨著Hg2+濃度的增大而增大，說明Hg2+對NAGase的抑制是屬于競爭性抑制作用。Hg2+與底物之間競爭地與NAGase活性中心結合，從而影響了NAGase與底物的親和力，Hg2+只與游離酶(E)結合，而不與酶-底物絡合物(ES)結合。以圖4a各直線斜率對相應的Hg2+濃度作圖(圖4b)，得到一條直線，直線方程為y=1.323×10-3x+0.030，從直線方程可以求得Hg2+對中國鱟NAGase的抑制常數KI為22.68 μmol·L-1。

同樣，研究了Pb2+對中國鱟NAGase的抑制類型，Lineweaver-Burk雙倒數作圖(圖5a)，結果顯示，5條直線在第二象限相交于一點，各直線在橫軸的截距和在縱軸的截距都隨Pb2+濃度的變化而變化，隨著Pb2+濃度的增大，NAGase相應的Kmapp值增大，而相應的Vmapp值下降。以圖5a各直線斜率對Pb2+濃度進行二次作圖(圖5b)，得到一直線，直線方程為y=1.516×10-3x+0.029，求出Pb2+對酶的抑制常數(KI)為19.13 mmol·L-1，即競爭性抑制常數；再以圖5a各直線在縱軸的截距對Pb2+濃度作圖(圖5c)，得到一直線，直線方程為y=0.997×10-3x+0.075，求出Pb2+對ES的抑制常數(KIS)為75.23 mmol·L-1，即非競爭性抑制常數KIS為75.23 mmol·L-1，KI

圖4 Hg2+對中國鱟腸道NAGase抑制作用的Lineweaver-Burk關系圖注：直線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for inhibitory effect of Hg2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatus Note: Concentrations of Hg2+ for curves 0～4 were 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1, respectively.

圖5 Pb2+對中國鱟腸道NAGase抑制作用的Lineweaver-Burk關系圖注：直線0～4，Pb2+濃度分別為0、15、20、25和30 mmol·L-1。Fig. 5 Lineweaver-Burk plots for inhibitory effect of Pb2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatusNote: Concentrations of Pb2+ for curves 0～4 were 0, 15, 20, 25 and 30 mmol·L-1, respectively.

2.4 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase內源熒光發(fā)射光譜的影響

目前，研究蛋白質溶液構象的主要方法包括紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜和核磁共振等[13]。本研究是通過測定酶的熒光光譜變化來判斷酶蛋白的空間構象的變化。由圖6可知，天然酶NAGase的熒光發(fā)射峰在332 nm處，加入效應物Hg2+后，酶蛋白的熒光強度發(fā)生了變化，隨著Hg2+濃度增大，酶的熒光強度逐漸下降，但酶的熒光發(fā)射峰沒有位移，熒光發(fā)射峰的波長基本不變。酶的熒光強度發(fā)生變化表明了相應的酶蛋白的空間構象發(fā)生了變化，說明Hg2+對中國鱟NAGase的抑制作用是通過改變酶的空間構象所致。

進一步研究了Pb2+對中國鱟NAGase內源熒光發(fā)射光譜的影響，由圖7可知，因為試驗采用的酶濃度與Hg2+試驗組不同，獲得的熒光發(fā)射強度也有差異。結果表明，隨著效應物Pb2+濃度增大，NAGase的熒光強度逐漸下降，當Pb2+濃度為500 μmol·L-1時酶的熒光消失，但酶的熒光發(fā)射峰始終沒有產生位移。這說明Pb2+與中國鱟NAGase分子的結合致使酶蛋白空間構象產生變化，酶活力下降，酶熒光發(fā)射強度隨之改變。

圖6 中國鱟NAGase在HgCl2中的內源熒光發(fā)射光譜注：曲線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 6 Fluorescence emission spectra of NAGase from Tachypleus tridentatus in HgCl2 solutionNote: Concentrations of 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1 for curves 0～4, respectively.

圖7 中國鱟NAGase在Pb(NO3)2中的內源熒光發(fā)射光譜注：曲線0～6，Pb(NO3)2濃度分別為0、50、75、100、200、400和500 μmol·L-1。Fig. 7 Fluorescence emission spectra of NAGase from Tachypleus tridentatus in Pb(NO3)2 solutionNote: Concentrations of 0, 50, 75, 100, 200, 400 and 500 μmol·L-1 for curves 0～6, respectively.

3 討論(Discussion)

重金屬離子對酶經常呈現抑制現象，但不同重金屬離子對NAGase的抑制機理和抑制類型不同。楊學敏等[14]的研究表明：Fe3+和Cd2+對鋸緣青蟹內臟NAGase的抑制均呈競爭性-反競爭性混合Ⅱ型效應。而Zn2+對鋸緣青蟹NAGase則呈現可逆的混合型抑制作用，結果顯示，Zn2+與游離酶(E)的親和力比Zn2+與酶-底物絡合物(ES)的親和力強，在Zn2+作用下NAGase的熒光發(fā)射強度降低，說明Zn2+是通過改變酶蛋白空間構象變化致使酶活力下降[8]；但ZnSO4對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[15]精巢NAGase表現為競爭性的抑制作用。王君等[16]的研究表明，Cu2+對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)蛹NAGase的抑制作用是一種可逆的混合型抑制；而CuSO4對尼羅羅非魚精巢NAGase的抑制則為非競爭性抑制作用[15]，同時，在CuSO4作用下酶的熒光發(fā)射峰值呈降低現象。此外，Ag+對克氏原螯蝦內臟NAGase的抑制作用又表現為反競爭性抑制[7]；而鎘離子對尼羅羅非魚精巢NAGase的抑制為競爭性抑制作用[17]。

Hg2+對酶往往有較強的抑制作用，其對不同性質的酶或對不同來源的酶作用機理同樣存在差異。蔡西玲等[18]研究了Hg2+對木瓜蛋白酶的抑制機理，結果表明，當CHg2+≤10-6mol·L-1時，對酶表現為非競爭性不可逆激活作用，但當CHg2+≥10-4mol·L-1時，對酶的抑制作用呈現以競爭性抑制為主，Hg2+可與酪蛋白競爭性地與木瓜蛋白酶的活性中心結合，導致對酶的抑制，同時Hg2+結合后木瓜蛋白酶的熒光猝滅，熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移，表明Hg2+與酶蛋白之間存在相互作用，發(fā)生了能量轉移，Hg2+可能導致木瓜蛋白酶分子的微環(huán)境疏水性有所降低，從而引起酶活力的下降。而耿芳宋等[19]的研究表明，Hg2+是人胎盤耐熱性堿性磷酸酶的混合性抑制劑，并使酶的構象發(fā)生改變，當CHgCl2>1.00 mmol·L-1時，熒光強度不斷下降，但峰位不變。此外，Hg2+對鋸緣青蟹內臟NAGase的抑制表現為可逆的競爭性抑制作用[20]，但對尼羅羅非魚精巢NAGase又表現為不可逆抑制作用[21]。已有研究還發(fā)現，Hg2+對凡納對蝦內臟NAGase的不可逆抑制作用，可能是Hg2+與酶蛋白的巰基結合從而引起酶的空間結構變化，導致酶失活，而且底物還具有保護Hg2+所引起的酶失活作用[9]。本研究結果表明，Hg2+對中國鱟NAGase抑制作用表現為可逆的競爭性抑制，在Hg2+作用下NAGase熒光強度降低，但酶的內源熒光發(fā)射峰沒有位移，說明Hg2+對NAGase催化活力的抑制是酶的空間構象發(fā)生變化所致，Hg2+可能也是與中國鱟NAGase酶蛋白的巰基產生鰲合作用而引起空間構象的變化。

Pb2+對酶的抑制機理目前研究的還不多。有研究表明，Pb(NO3)2是人胎盤耐熱性堿性磷酸酶的反競爭性抑制劑，在不同濃度Pb(NO3)2的作用下，堿性磷酸酶的熒光強度和發(fā)射峰位均發(fā)生了變化，當Pb(NO3)2濃度為10.0 mmol·L-1時，酶活力喪失，熒光猝滅[19]；而Pb2+對克氏原螯蝦內臟NAGase的抑制又表現為非競爭性抑制[7]。從本研究結果可知，Pb2+對中國鱟內臟NAGase的抑制是一個可逆的過程，屬于競爭性-非競爭性混合型抑制作用，比較了抑制常數KIS和KI值大小，發(fā)現Pb2+在游離酶和絡合物之間，更易于與游離酶結合而引起對酶的抑制作用。Pb2+可使得中國鱟NAGase的內源熒光發(fā)射強度改變，但沒有產生峰值移位現象，當Pb(NO3)2濃度是0.5 mmol·L-1時，NAGase的內源熒光猝滅(圖7)，而這時酶活力才剛開始下降(圖1)，這種現象說明了Pb2+使酶蛋白空間構象發(fā)生變化要快于造成的酶活力的變化，維系酶空間構象穩(wěn)定的必需基團對Pb2+相當敏感，這與張偉妮等[15]研究的CuSO4對尼羅羅非魚精巢NAGase活力和構象的影響結果相似；但Zhang等[8]在Zn2+對鋸緣青蟹NAGase抑制動力學的研究中，發(fā)現Zn2+作用后NAGase活力的變化快于酶空間構象的變化。同時，進一步推測Pb2+可能是與NAGase的必需基團巰基形成鰲合物，或可能是與酶活性中心的羧基結合，從而導致酶蛋白空間構象變化[19]。

綜上所述：Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用均表現為可逆過程，其中Hg2+對NAGase的抑制屬于競爭性抑制作用，Hg2+只與游離酶結合，不與酶-底物絡合物結合；而Pb2+對NAGase的抑制是屬于競爭性-非競爭性混合型抑制作用，相比于酶-底物絡合物，Pb2+對游離酶的親和力更強。Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用都是酶蛋白空間構象的變化所致。而Hg2+和Pb2+與NAGase酶蛋白功能基團之間的互作機制有待進一步探討。

致謝：感謝莆田學院環(huán)境與生物工程學院林授鍇博士和汪秀妹博士在英文摘要寫作上給予的幫助。