張 揚，朱彩平，林楊楠，曹鈺林，張一凡，方 豪

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西省食品與健康科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，陜西 西安 710119）

肝臟是脊椎動物體內(nèi)的重要代謝器官，發(fā)揮著去除毒素、調(diào)節(jié)免疫、儲存糖原、合成分泌性蛋白質(zhì)等作用。肝損傷主要指肝細(xì)胞在乙醇、病毒、藥物、毒物等因素的誘導(dǎo)下引發(fā)的病變。長期肝損傷不可修復(fù)，并會導(dǎo)致肝臟代償性修復(fù)，即形成肝纖維化，可進一步發(fā)展為肝硬化或者肝癌[1-2]。臨床上的多種藥物可以引起肝損傷，如抗菌藥物、中樞抑制藥、抗腫瘤藥等[3]。因此，從天然產(chǎn)物中提取保肝物質(zhì)越來越引起人們的重視。

多糖是一種天然的高分子聚合物，廣泛地存在于動植物和微生物中[4-5]。研究表明，多糖具有潛在的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗衰老[9]及免疫調(diào)節(jié)[10-11]等多種功能，被廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥業(yè)。平菇是我國最常見的食用菌類之一，因味道鮮美而受到廣泛喜愛，含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)素[12-13]。研究表明，平菇富含多糖，且平菇多糖（Pleurotus ostreatuspolysaccharide，POP）具有良好的抗氧化[14]、增強免疫力[15]、抗腫瘤[16]等功效。然而，POP的保肝作用尚鮮見報道。本實驗擬研究POP對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)雄性昆明種小鼠肝損傷的保護作用，為開發(fā)POP保肝產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK（陜）2018-001。

新鮮平菇 陜西省西安市長安區(qū)大居安蔬菜批發(fā)市場。

無水乙醇、4%多聚甲醛溶液 西安晶博生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 北京BSISL有限公司；全波長酶標(biāo)儀美國賽默飛世爾公司；勻漿機 美國Pro Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 POP的提取

新鮮平菇烘干、粉碎，得到平菇干粉，其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.04%。稱取25 g平菇干粉，加入1.0 L蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬笾糜?5 ℃水浴提取4 h。冷卻后用紗布濾去不溶物，溶液以4 000 r/min離心20 min，取上清液，蒸發(fā)濃縮，加入4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液沉淀8 h，抽濾得沉淀，再將沉淀復(fù)溶于一定體積蒸餾水中，用8 000～14 000 Da透析袋透析72 h，冷凍干燥后得到POP。

1.3.2 動物分組與處理

48 只雄性昆明種小鼠飼養(yǎng)于（22±2）℃、12 h光照/12 h黑暗室內(nèi)，自由飲水進食。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后將小鼠隨機分為6 組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、POP低/中/高劑量組（POP-L/M/H），每組8 只。空白對照組與模型組每天用0.2 mL生理鹽水（0.1 mL/10 g）進行灌胃；陽性對照組用50 mg/（kg·d）的VC進行灌胃[17]；POP-L/M/H組分別用100、200、400 mg/（kg·d）的POP進行灌胃，連續(xù)給藥28 d。在第22、23天對除空白組外的小鼠進行肝損傷造模，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% CCl4-花生油溶液，劑量為10 mL/kg mb，空白組注射花生油。在第28天的最后一次灌胃結(jié)束以后，所有小鼠禁食不禁水12 h，記錄體質(zhì)量，頸椎脫臼處死。

1.3.3 血清的制備

小鼠處死后立即眼球取血，將血液收集于1.0 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，制得血清立即存放于-20 ℃冰箱，待測。

1.3.4 血清指標(biāo)的測定

按照試劑盒操作說明測定血清中AST、ALT、ALP活力及TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度。

1.3.5 肝臟組織指標(biāo)的測定

小鼠處死后立即解剖取出肝臟組織，稱質(zhì)量并記錄，按下式計算小鼠肝臟指數(shù)。隨后精確稱取0.5 g肝臟組織，加入無菌生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝組織勻漿。將制備好的肝勻漿5 000 r/min離心10 min，取上清液并稀釋至適宜濃度，按試劑盒操作說明測定肝臟中T-AOC、MDA濃度及T-SOD、CAT、GSH-Px活力。

式中：m1為小鼠肝臟質(zhì)量/g；m2為小鼠體質(zhì)量/g。

1.3.6 肝臟組織病理學(xué)檢測

取小塊肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色[18]。制成切片后用光學(xué)顯微鏡觀察肝細(xì)胞病變程度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件作圖，SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用t檢驗，P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP對小鼠體質(zhì)量的影響

POP對小鼠平均體質(zhì)量的影響如圖1所示，第1～3周，各組小鼠在自然生長狀態(tài)下，平均體質(zhì)量呈上升趨勢，且POP-H組小鼠平均體質(zhì)量略高于其他各組小鼠。在第22、23天腹腔注射CCl4后，除空白組小鼠體質(zhì)量繼續(xù)增加外，其他組小鼠體質(zhì)量均降低。另外，POP-L/M/H組的小鼠體質(zhì)量下降程度隨著POP劑量的增加而減少?？梢钥闯觯琍OP能夠抑制CCl4引起的小鼠體質(zhì)量下降。

圖1 POP對小鼠平均體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of POP on average body mass in mice

2.2 POP對小鼠肝臟指數(shù)的影響

表1 POP對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of POP on hepatic index in mice with CCl4-induced liver injury

CCl4是一種被廣泛用來誘導(dǎo)實驗動物肝損傷的化學(xué)藥物，CCl4進入機體可以產(chǎn)生高反應(yīng)活性的三氯甲基自由基，從而引發(fā)肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并導(dǎo)致肝小葉中心壞死，進而引發(fā)肝壞死、肝纖維化、肝硬化等疾病[19]。同時CCl4作為一種典型的肝臟毒物，能夠破壞肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜的通透性增加并失去對大分子物質(zhì)的阻礙能力，生物體內(nèi)的大分子物質(zhì)會回流入細(xì)胞膜內(nèi)，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹壞死[20]，最終表現(xiàn)為肝臟體積腫脹、質(zhì)量增加。從表1可以看出，模型組小鼠肝臟指數(shù)極顯著高于空白對照組小鼠（P＜0.01），說明模型組小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，造模成功。同時，POP-H組小鼠肝臟指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05），且POP-H組小鼠極顯著低于模型組（P＜0.01），說明POP對CCl4引起的肝臟腫脹有抑制效果，且與劑量呈正相關(guān)。

2.3 POP對肝損傷小鼠血清指標(biāo)的影響

肝臟微粒體細(xì)胞色素P-450會激活進入肝臟內(nèi)的CCl4，產(chǎn)生三氯甲基自由基，三氯甲基自由基會破壞細(xì)胞膜上的磷脂分子，使細(xì)胞膜完整性遭到破壞，引起細(xì)胞內(nèi)各種酶的滲漏[21]。ALT和AST由于肝細(xì)胞膜的通透性被隔絕于肝細(xì)胞線粒體和細(xì)胞漿中（正常肝細(xì)胞ALT和AST不會滲漏[22]），因此血清中ALT和AST很少。當(dāng)肝細(xì)胞受到自由基攻擊或壞死時，細(xì)胞中的ALT和AST大量外泄，血清中的ALT和AST活力顯著提高，標(biāo)志著肝細(xì)胞遭到破壞，是鑒定肝損傷的重要指標(biāo)。ALP正常情況下主要來自于骨骼，由膽道系統(tǒng)排泄，當(dāng)肝臟受到損傷時，ALP會反流入血液從而引起血清中的ALP活力顯著提高[23]。

表2 POP對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT、AST和ALP活力的影響Table 2 Effect of POP on ALT, AST and ALP levels in serum of mice with CCl4-induced liver injury

從表2可以看出，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST及ALP活力均極顯著升高（P＜0.01），說明小鼠肝細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞酶發(fā)生滲漏，標(biāo)志著肝細(xì)胞受到破壞，造模成功。POP-M/H組小鼠血清中ALT、AST及ALP活力相比模型組極顯著降低（P＜0.01），說明POP能夠保護由CCl4引起的小鼠肝損傷。

2.4 POP對肝損傷小鼠血脂水平的影響

動脈粥樣硬化和心血管疾病通常由血清中TC、TG和LDL-C濃度的增高以及HDL-C濃度的降低引起[24]。CCl4產(chǎn)生的三氯甲基自由基及一系列活性氧與蛋白質(zhì)共價結(jié)合導(dǎo)致蛋白合成障礙，影響脂質(zhì)分解代謝，使TG大量積累。

表3 POP對肝損傷小鼠血清血脂水平的影響Table 3 Effect of POP on serum lipid levels in mice with CCl4-induced liver injury

由表3可知，與空白對照組相比，模型組的TC、TG和LDL-C濃度極顯著提高（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，POP-L/M/H組小鼠血脂水平均出現(xiàn)明顯下降，其中POP-M組血清TC濃度顯著降低（P＜0.05），TG及LDL-C濃度均極顯著降低（P＜0.01）；POP-H組小鼠血清血脂濃度（除HDL-C外）均極顯著降低（P＜0.01），且均接近空白對照組小鼠，說明POP能夠有效降低血清中TC、TG和LDL-C濃度。

HDL-C是脂蛋白的一種，可運輸機體組織內(nèi)的膽固醇到肝臟，從而抑制心血管疾病的發(fā)生，低濃度的HDL-C有誘發(fā)動脈粥樣硬化的風(fēng)險。由表3可知，模型組小鼠血清中HDL-C濃度相比空白對照組極顯著降低（P＜0.01），而POP-M/H組的小鼠血清中HDL-C濃度相比模型組極顯著提高（P＜0.01），這一現(xiàn)象說明POP能夠改善CCl4引起的小鼠HDL-C濃度下降，維持血液中TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度的平衡，從而預(yù)防或緩解動脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)生。

2.5 POP對肝損傷小鼠肝臟酶活力的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是一種能對人體造成損傷的損害因子，通常被用來鑒別一系列的組織損傷，它的含量能反映體內(nèi)氧化反應(yīng)的程度[25]，因此本實驗以MDA濃度反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度；SOD是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，能夠清除機體內(nèi)的有害物質(zhì)如超氧陰離子自由基，保護細(xì)胞免受損傷，間接地反映了機體清除體內(nèi)氧自由基的能力[26]；T-AOC與機體健康存在密切聯(lián)系，能反映機體防御體系抗氧化能力的強弱，這種防御體系主要通過清除機體內(nèi)的活性氧以阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，阻斷過氧化鏈[27]；CAT參與機體內(nèi)活性氧的代謝，促進機體清除自由基以阻止細(xì)胞膜受到損傷[28]；GSH-Px能夠催化分解機體內(nèi)產(chǎn)生的，通常與SOD協(xié)同作用，SOD首先催化超氧陰離子自由基生成O2和H2O2，生成的H2O2在GSH-Px的催化下轉(zhuǎn)換成H2O和O2[30]。因此，小鼠肝臟內(nèi)的T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平可以反映CCl4引起的小鼠肝損傷程度。

表4 POP對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平的影響Table 4 Effect of POP on MDA, T-SOD, T-AOC, CAT and GSH-Px levels in liver tissue of mice with CCl4-induced liver injury

從表4可知，模型組小鼠肝組織MDA濃度相比空白對照組極顯著提高（P＜0.01），說明CCl4對小鼠肝臟造成損傷；同時，模型組小鼠肝組織T-SOD、CAT、GSH-Px活力及T-AOC極顯著降低（P＜0.01），說明小鼠肝臟酶活力受到嚴(yán)重破壞，造模成功。POP-L/M/H組小鼠肝臟酶活力相比模型組均提高，MDA濃度降低，其中POP-M組小鼠肝組織MDA濃度極顯著降低（P＜0.01）、T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平極顯著提高（P＜0.01），而POP-H組小鼠肝組織酶活力相比模型組均極顯著提高（P＜0.01）。

2.6 POP對肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，肝竇正常，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠肝細(xì)胞變性明顯，可見多處細(xì)胞壞死，且細(xì)胞有浸潤現(xiàn)象，細(xì)胞核萎縮，出現(xiàn)固縮溶解現(xiàn)象（圖2）。相比模型組小鼠，POP-L/M組小鼠肝組織細(xì)胞壞死雖然減少，但細(xì)胞浸潤現(xiàn)象依然存在；POP-H組小鼠肝組織相比模型組小鼠病理損傷程度明顯減輕，肝細(xì)胞排列比較整齊，細(xì)胞核較模型組圓潤，壞死區(qū)域明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤程度也明顯降低。

圖2 CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果（400×）Fig. 2 Histopathological examination of CCl4-induced liver injury in mice (400 ×)

3 結(jié) 論

相比模型組小鼠，POP-H組（400 mg/（kg·d））小鼠體質(zhì)量降低程度有所減緩，肝臟腫脹程度減輕，肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)有明顯改善，血清中AST、ALT、ALP活力極顯著降低（P＜0.01），TC、TG和LDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），HDL-C濃度回升，說明POP有助于預(yù)防動脈粥樣硬化和心血管疾??；同時，MDA濃度極顯著降低（P＜0.01），T-SOD、T-AOC、CAT和GSH-Px水平極顯著提高（P＜0.01），說明POP能夠抑制CCl4引起的肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高肝臟內(nèi)抗氧化酶活力，保護小鼠肝臟。肝臟病理學(xué)研究結(jié)果也表明，POP可以明顯減輕小鼠肝細(xì)胞所受的病理損傷。綜上，POP對CCl4引起的小鼠肝損傷具有明顯的保護作用，在保健食品和藥物治療方面有廣闊的發(fā)展空間。