車文文，郭永明，王 丹，趙舒蒙，郭 義，章明星

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617）

周圍神經(jīng)損傷（PNI）是臨床常見疾病，交通事故是導(dǎo)致PNI 的主要原因[1]。雖然周圍神經(jīng)損傷后可以再生，但是其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，致使周圍神損傷后的功能恢復(fù)率只能達(dá)到損傷前的70%左右[2]。PNI還會(huì)導(dǎo)致骨骼肌失去神經(jīng)支配，長期失神經(jīng)狀態(tài)則會(huì)引起肌容量喪失、肌纖維重構(gòu)，肌衛(wèi)星細(xì)胞減少等病理改變，最終造成不可逆的失神經(jīng)性肌萎縮，致使運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)不理想[3-4]。近些年來神經(jīng)修復(fù)水平有了明顯的提高，但神經(jīng)功能恢復(fù)效果仍不盡如人意。大量研究表明電針療法對PNI 治療效果顯著[5]。團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果已表明電針治療周圍神經(jīng)損傷有效[6-7]。然而，電針對PNI 治療作用的具體機(jī)制尚不完全明確，還需要進(jìn)一步的研究。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是從轉(zhuǎn)錄組水平來研究基因表達(dá)譜的一個(gè)新的技術(shù)手段，其憑借高靈敏度、高通量和低成本的優(yōu)勢成為從全基因組水平研究基因表達(dá)的主要方法[8]。本研究利用高通量測序技術(shù)對坐骨神經(jīng)損傷局部神經(jīng)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對獲得的差異表達(dá)基因開展功能注釋、信號通路分析等方面的研究，以進(jìn)一步闡明電針治療周圍神經(jīng)損傷的作用機(jī)制，為電針進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R 原則”，本實(shí)驗(yàn)選取Wistar 大鼠9 只[4-5]，雄性，8 周齡，SPF 級，隨機(jī)分為空白組、模型組、電針模型組，對電針模型組、模型組建立坐骨神經(jīng)橫斷傷模型，電針刺激患側(cè)環(huán)跳（+）、足三里（-），電針參數(shù)：輸出頻率5 赫茲，斷續(xù)波，15 min，強(qiáng)度以患肢輕微顫動(dòng)為度。電針6 d 后，在坐骨神經(jīng)橫斷傷處，以損傷處為中心取1 cm 長的神經(jīng)組織樣品，并迅速置于液氮中，然后放入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍保存，用于RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 測序方法 進(jìn)行樣品的total RNA 抽提，后純化total RNA，再進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的RNA 可進(jìn)行后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn)。對純化后的total RNA 進(jìn)行rRNA去除、片段化、第1 鏈cDNA 合成、第2 鏈cDNA 合成、末端修復(fù)、3'末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建，文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測序，進(jìn)行雙端測序。對測序得到的raw reads 進(jìn)行質(zhì)控。所有的樣品測序量都滿足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 以P≤0.05、Fold-change≥2為條件，篩選3 個(gè)樣本的差異表達(dá)基因。模型組與空白組相比，檢測到4170 個(gè)顯著性差異基因，下調(diào)差異基因3 001 個(gè)，上調(diào)差異基因1 169 個(gè)（圖1）。電針模型組和模型組相比，檢測出104 個(gè)顯著性差異基因，80 個(gè)差異基因下調(diào)，24 個(gè)差異基因上調(diào)（圖2）。其中有69 條基因造模后表達(dá)趨勢與電針后表達(dá)趨勢相反，62 條基因造模后表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過電針后表達(dá)下調(diào)，7 條基因造模后表達(dá)下調(diào)，經(jīng)過電針后表達(dá)上調(diào)，因此這69 個(gè)基因是3 組共同差異表達(dá)基因，其在模型制備以及電針干預(yù)后均發(fā)生顯著的差異表達(dá)。這些差異基因中經(jīng)過電針刺激后，上調(diào)最明顯的5 個(gè)基因?yàn)椋篒gh-1a、Igkc、Ncald、Igf2、Has3；下調(diào)最明顯的5 個(gè)基因?yàn)椋篢chh、AABR07052585.1、Myh1、Mylpf、Actn3。

2.2 差異表達(dá)基因GO 功能注釋及顯著性分析 基因本體論（GO）是一個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)，提供了一個(gè)全面描述生物體的基因?qū)傩院突虍a(chǎn)物的動(dòng)態(tài)更新詞匯庫[11]。將模型組與空白組、電針模型組與模型組的差異基因做GO 功能分類統(tǒng)計(jì)，從生物工程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3 個(gè)方面進(jìn)行基因功能分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0．05。

圖1 空白組和模型組差異基因火山圖

圖2 電針模型組和模型組差異基因火山圖

圖3 空白組與模型組差異基因GO 分類結(jié)果

圖4 空白組與模型組差異基因GO 富集結(jié)果

圖5 電針模型組與模型組差異基因GO 分析結(jié)果

圖6 電針模型組與模型組差異基因GO 富集結(jié)果

空白組與模型組共45 187 個(gè)基因得到了注釋，BP 類別中：細(xì)胞過程、單一生物過程所含基因最多，CC 類別中：細(xì)胞、細(xì)胞部分類所占比例最高，MF類別中：結(jié)合、催化活性類所包含的基因最多；GO功能富集主要與細(xì)胞發(fā)育、遷移，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等相關(guān)（圖3、圖4）。電針模型組與模型組共92 個(gè)差異基因得到分類注釋，BP 類別中細(xì)胞過程和單一生物過程包含的基因最多，在CC 類別中：細(xì)胞類、細(xì)胞部分類所占比例最高，而在MF 類別中：占主導(dǎo)地位的是結(jié)合類；GO 功能富集主要與鈣離子結(jié)合、免疫應(yīng)答、以及電壓門控陽離子通道活性等過程相關(guān)（圖5、圖6）。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG 通路分析 KEGG 數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。利用該數(shù)據(jù)庫有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。對差異基因進(jìn)行KEGG 分析，空白組與模型組差異表達(dá)基因分析主要涉及與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、全局和概覽圖相關(guān)的通路。電針模型組與模型組差異表達(dá)基因主要涉及免疫系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞群落3個(gè)方面，如圖7，8 所示。

對差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集，以P-value＜0．05 為標(biāo)準(zhǔn)，模型組與空白組之間的差異表達(dá)基因顯著富集了53 條KEGG 信號通路。電針模型組與模型組之間的差異表達(dá)基因涉及了19 條KEGG 信號通路，去掉與研究方向無關(guān)的通路，剩余可能與研究方向相關(guān)的通路8 個(gè)，富集結(jié)果如表1 所示。

3 討論

周圍神經(jīng)損傷是常見的致殘性疾病，屬于中醫(yī)“痹癥”、“痿證”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》就提出“治痿獨(dú)取陽明”的理論。在本次實(shí)驗(yàn)中，選擇“環(huán)跳”、“足三里”兩穴，環(huán)跳穴位于足少陽膽經(jīng)上，主要用于下肢痿痹等疾病的治療，足三里穴屬于足陽明胃經(jīng)，補(bǔ)益要穴，電針刺激環(huán)跳、足三里可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，深刺可以增加神經(jīng)生長因子的表達(dá)[12-13]。研究表明電針療法不僅具有針刺穴位本身的作用，還可以產(chǎn)生弱電場，促進(jìn)再生神經(jīng)向陰極生長，且5 Hz 電針對于神經(jīng)損傷的再生修復(fù)作用優(yōu)于高頻電針[14-15]。故本實(shí)驗(yàn)選擇環(huán)跳為陽極足三里為陰極，電針參數(shù)選擇斷續(xù)波、5 Hz，強(qiáng)度以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)。

圖7 電針模型組與模型組差異基因KEGG 分析結(jié)果

圖8 空白組與模型組差異基因KEGG 分析結(jié)果

表1 模型組與電針組KEGG 富集通路結(jié)果

目前，針灸治療周圍神經(jīng)損傷經(jīng)過大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究已被證明是一種行之有效的方法。大量基礎(chǔ)研究顯示，電針能夠改善周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)終板內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)含量和結(jié)構(gòu)，能夠延緩肌肉的萎縮，促進(jìn)神經(jīng)生長相關(guān)因子的增多、促進(jìn)雪旺細(xì)胞大量增生并且分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)，抑制脊髓前角和背根神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后形態(tài)和功能恢復(fù)[16-22]。近年來學(xué)者們逐漸認(rèn)識(shí)到周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)與再生的微環(huán)境是決定其結(jié)局的關(guān)鍵，此微環(huán)境可概括為神經(jīng)再生通道建立、神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)、信號通路調(diào)控及酶的調(diào)節(jié)等6 個(gè)方面，有研究表明電針對神經(jīng)修復(fù)機(jī)制可能與神經(jīng)損傷后神經(jīng)元、軸突的再生記憶微環(huán)境的改變有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確，還需要進(jìn)一步的研究[23-26]。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是從轉(zhuǎn)錄組水平來研究基因表達(dá)譜的一個(gè)新的技術(shù)手段，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于挖掘功能基因、開發(fā)分子標(biāo)記、揭示代謝調(diào)控途徑等方面，本研究采用該技術(shù)獲取大量電針治療周圍神經(jīng)損傷的轉(zhuǎn)錄信息，并對差異基因進(jìn)行定量、定性研究，篩選電針對神經(jīng)的修復(fù)機(jī)制可能激活的信號通路，進(jìn)一步闡釋電針的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明空白組、模型組、電針模型組間基因有顯著的區(qū)別，說明電針后的大鼠在基因表達(dá)水平上存在特異表現(xiàn)，揭示這些差異表達(dá)基因可能在坐骨神經(jīng)損傷的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色?？瞻捉M與模型組共篩選出4 170 個(gè)顯著性差異基因，其中3 001 個(gè)基因在模型組中表達(dá)下調(diào)，1 169 個(gè)基因在模型組中表達(dá)上調(diào)；電針組和模型組一共檢測出104 個(gè)差異表達(dá)基因顯著,其中24 個(gè)基因在電針組組織中表達(dá)上調(diào)，80 個(gè)基因在電針組組織中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步的篩選發(fā)現(xiàn)差異最為顯著的30 個(gè)基因中，20 個(gè)為下調(diào)基因，10 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，表達(dá)顯著上調(diào)的前5 位基因是：AABR07051592.2、Igkc、Igh-1a、Igf2、LOC100912707；表達(dá)顯著下調(diào)的前5 位基因是：Acta1、Myh1、Ryr1、Myl1、Mylpf。GO富集分析結(jié)果表明電針可能是通過對免疫過程、離子通道、細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)而達(dá)到對周圍神經(jīng)損傷的治療作用。KEGG 分析表明經(jīng)過電針以后主要涉及免疫系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞群落3 個(gè)方面的變化，其中細(xì)胞群落中涉及粘著斑、黏合連接、緊密連接等方面的變化，免疫系統(tǒng)中涉及補(bǔ)體、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移、趨化因子信號通路、造血細(xì)胞系等方面的變化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面涉及cAMP 信號通路、AMPK 信號通路、FoxO 信號通路、TGF-β 信號通路、ras 信號通路、鈣信號通路、cgmp-pkg 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等方面的變化，表明電針可能通過調(diào)控某些基因的表達(dá)從而影響神經(jīng)的傳導(dǎo)及機(jī)體免疫功能的改變；結(jié)合KEGG 富集分析結(jié)果，基于電針治療周圍神經(jīng)損傷研究現(xiàn)狀篩選了可能與研究方向相關(guān)的8 個(gè)通路：白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路、γ-氨基丁酸能突觸通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺突觸通路、鈣信號通路、緊密連接通路、粘著斑通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控通路。

綜上所述，電針治療周圍神經(jīng)損傷機(jī)制可能是通過改變細(xì)胞電位平衡、神經(jīng)元軸突再生骨架結(jié)構(gòu)的重建以及白細(xì)胞的遷移而改變周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)與再生的微環(huán)境，然而具體的分子機(jī)制還需結(jié)合相關(guān)的差異基因及具體信號通路，進(jìn)一步研究。