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        清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠抗腫瘤作用與MARK 信號(hào)通路的關(guān)系*

        2020-01-08 07:05:48溫利娟薛曉鷗
        關(guān)鍵詞:中藥方外治法空白對(duì)照

        溫利娟,薛曉鷗,米 鑫,謝 偉

        (1.北京市順義區(qū)婦幼保健院,北京 101300;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院,北京 100700)

        宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,在女性惡性腫瘤中排名第三,且85%以上新發(fā)及死亡病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家,中國(guó)是世界上宮頸癌高發(fā)國(guó)家,患病和死亡人數(shù)占全世界1/4[1]。目前,宮頸癌常用的西醫(yī)治療方法為手術(shù)治療和放療,輔助方法有化療[2]。在宮頸癌治療中,中醫(yī)藥治療尚不能替代手術(shù)、放療及化療等治療方法。但是在手術(shù)、放療、化療過(guò)程中,根據(jù)患者個(gè)體差異,采用望、聞、問(wèn)、切四診合參,辨證論治后用內(nèi)服外用的中醫(yī)治療方法以扶正祛邪,能夠穩(wěn)定瘤體,有利于術(shù)后患者恢復(fù),提升患者自身免疫力,提高生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期,減輕患者在放化療過(guò)程中的毒副作用,以利于治療的順利進(jìn)行,有減毒增效之優(yōu)勢(shì)[3]。中醫(yī)學(xué)中并無(wú)宮頸癌病名,根據(jù)其臨床表現(xiàn),歸屬于中醫(yī)“癥瘕病”、“崩漏”、“帶下”等病范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的主要病機(jī)是正氣虛弱,邪毒客于子門(mén),瘀結(jié)胞中。“清熱利濕外治法”前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明:能改善陰道局部免疫微環(huán)境,上調(diào)HLA-I 和CD8 分子的表達(dá)而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒免疫殺傷功能而起到抑制HR-HPV 作用[4-9]。

        ERK 及P38 是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一,ERK 家族有5 個(gè)亞族,包括ERK1-ERK5。其中ERK1 及ERK2 通路中的兩個(gè)重要成員之一;主要參與并調(diào)節(jié)了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂及死亡等多種生理過(guò)程,并且在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。ERK 及P38 在腫瘤發(fā)生發(fā)展和防治中起著重要的作用,是目前腫瘤研究的重要熱點(diǎn)。

        本實(shí)驗(yàn)研究清熱利濕法體外抗腫瘤作用及機(jī)制,測(cè)量腫瘤體積及體質(zhì)量,計(jì)算抑瘤率,HE 染色法觀察腫瘤的形態(tài)學(xué)變化,并運(yùn)用免疫組化方法,檢測(cè)瘤體中p-ERK 及p-p38 蛋白表達(dá)水平,研究清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用,進(jìn)一步揭示其抗腫瘤作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/c(nu/nu)裸小鼠35 只,雌性,5~6 周齡,體質(zhì)量SPF 級(jí)BALB/cnu/nu,購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件:SPF 級(jí)BALB/c(nu/nu)裸小鼠均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi),醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度為50%~70%,動(dòng)物室溫為(24±2)℃,采用12 h 晝夜間斷照明,水料自由飲用。

        1.2 受試藥物 外用中藥方由百川飛虹技術(shù)有限公司生產(chǎn),注射用順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司,Anti-Human Papillomavirus 16(E7)antibody、Anti-ERK1+ERK2 antibody、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG、Anti-Human Papillomavirus 16(E6)+18(E6)antibody、Anti-Rb antibody、Anti-P53 antibody均購(gòu)自abcam,免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中衫生物科技有限公司。

        1.3 宮頸癌細(xì)胞株 宮頸癌Siha 細(xì)胞株,購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

        1.4 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司);酶標(biāo)儀(Thermo 公司);倒置顯微鏡(Nikon);生物潔凈使用超凈臺(tái)(Opti MAIR);低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);游標(biāo)卡尺(SYNTEK);高精度電子稱重天平(Ei)。

        2 方法

        2.1 宮頸癌Siha 細(xì)胞懸液制備 宮頸癌Siha 細(xì)胞株復(fù)蘇后行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是含10%胎牛血清、100mg/mL 鏈霉素和100 IU/m 青霉素的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用2.5%胰酶消化,離心,棄上清。培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度2×107/mL。

        2.2 動(dòng)物與分組 35 只裸小鼠隨機(jī)分為清熱利濕外治法高劑量組、中劑量、低劑量、順鉑組、空白對(duì)照組。裸鼠購(gòu)買(mǎi)后,預(yù)先在室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng),觀察3 天。每只裸鼠用0.5 mL 注射器將0.2 mL 濃度為2×107/mL 的細(xì)胞懸液在無(wú)菌條件下皮下注射于裸鼠右前肢腋窩處皮下。在無(wú)特定病原體(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)裸鼠,并觀察裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及腫瘤生長(zhǎng)情況,以皮下結(jié)節(jié)直徑>0.5 cm 為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。裸鼠成瘤后,將裸鼠稱重,用隨機(jī)數(shù)字表法分成5 組,每組7 只,進(jìn)行給藥。

        2.3 各組給藥方法 ①外用中藥方高劑量組:0.942 8mg/kg;②中劑量組:0.471 4mg/kg;③低劑量組:0.235 7 g/kg;④順鉑組:濃度為5mg/kg,用量為0.5 mL,腹腔內(nèi)注射,每4 天1 次;⑤空白對(duì)照組:不用藥物觀察。清熱利濕外治法各組均使用無(wú)菌棉簽將藥物涂抹在裸鼠瘤體表面,每日一次。各組用藥和觀察時(shí)間均為4 周。

        2.4 觀察指標(biāo) 每日觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、飲食、排便情況、皮下種植區(qū)外觀及觸感,每日用藥前測(cè)量裸鼠瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b),測(cè)量裸鼠體質(zhì)量。治療過(guò)程中死亡裸鼠,均行解剖以明確死因。停藥24 小時(shí)后,用裸鼠頸椎脫臼法處死裸鼠,剝?nèi)×鼋M織,并瘤組織稱重、進(jìn)行體積測(cè)量,計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積(V)=ab2/2,抑瘤率=[(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)÷對(duì)照組平均瘤重]×100%。

        2.5 HE 染色 1)二甲苯2 次去蠟處理,每次15 min。2)將切片進(jìn)行清洗:100%乙醇5 min 共2 次,80%乙醇5 min 1 次,蒸餾水5 min 1 次。3)蘇木精液染色5 min。4)流水沖洗5 min,1%鹽酸乙醇30 sec,水洗30 sec,蒸餾水過(guò)洗5 次。5)0.5%伊紅液染色3 min,蒸餾水稍洗30 sec,80%乙醇稍洗30 sec,95%乙醇1 min 2 次,無(wú)水乙醇3 min 2 次,二甲苯3 min 2 次。6)中性樹(shù)膠封固。

        2.6 免疫組化SP 法 第一天:將切片放入37 ℃烘培箱內(nèi)30 min,取出后室溫放置10 min;脫蠟:將切片放入純二甲苯中脫蠟3 次,每次15 min;將切片放入100%酒精2 次,每次10 min;將切片放入90%酒精2 次,每次10 min;將切片放入80%酒精1 次,每次10 min;將切片放入70%酒精1 次,每次10 min;將切片放入蒸餾水中3 min;將切片放入PBS 中3 次,每次3 min;滅活:雙氧水直接滴加,室溫內(nèi)放置10 min;PBS 洗3 次,每次3 min;熱修復(fù)抗原:將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中,大火煮沸3 min;室溫內(nèi)靜置2 h 直至完全冷卻,PBS 洗3 次,每次3 min;滴加5%BSA 封閉液,室溫放置20 min;滴加一抗,將切片放入濕盒中,4 ℃冷藏冰箱內(nèi)過(guò)夜。第二天:將濕盒從冰箱內(nèi)取出,PBS 洗3 次,每次2 min;滴加二抗,室溫放置20 min,PBS 洗3 次,每次2 min;滴加SABC,室溫放置20min,PBS 洗4 次,每次5 min;DAB 室溫顯色,蒸餾水洗滌中止反應(yīng),自來(lái)水沖洗30 min;⑤蘇木素輕度復(fù)染,40~45 s,自來(lái)水流水沖洗30 min 中止反應(yīng);將切片放入70%酒精1 次10 min;80%酒精1 次10 min;將切片放入90%酒精2 次,每次10 min;將切片放入100%酒精2 次,每次10 min;封片:中性樹(shù)膠封片,要求膠少,無(wú)氣泡。

        2.7 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化采用半定量法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平,是根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例:隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野,計(jì)算其中的陽(yáng)性細(xì)胞比例,然后評(píng)分,<5%為0 分,5%~25%為1 分,25%-50%為2 分;50%~75%為3 分;>75%為4 分。染色強(qiáng)度:無(wú)顯色為0 分,淺黃色或黃色為1 分,棕黃色為2 分,棕褐色為3 分。蛋白表達(dá)水平=陽(yáng)性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度。光鏡下p-ERK 和p-p38 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色,而細(xì)胞核不著色。

        2.8 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,瘤體生長(zhǎng)曲線采用重復(fù)測(cè)量方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,不同組間比較采用One-way ANOVA 分析,取P<0.05 作為顯著性差異水平。

        3 結(jié)果

        3.1 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況 雌性裸鼠接種Siha細(xì)胞后,2 d 種植區(qū)皮膚呈白色改變,3~4 d 白色皮膚改變消失,5~6 d 種植區(qū)皮下可觸及2~3 mm 瘤樣結(jié)節(jié),質(zhì)地韌,7~8 d 種植區(qū)皮下可觸及直徑5 mm瘤樣結(jié)節(jié),質(zhì)地稍硬。本實(shí)驗(yàn)35 只裸鼠成瘤率為100%。按裸鼠腫瘤體積大小隨機(jī)分5 組,每組7 只,治療前各組裸鼠平均體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

        圖1 成瘤裸鼠

        3.2 荷瘤裸鼠治療前后體質(zhì)量的變化 順鉑組裸鼠在用藥后一周均出現(xiàn)活動(dòng)量減少,厭食水,消瘦,皮膚干澀,其中2 只裸鼠分別在用藥第17、18 天死亡,死亡裸鼠解剖其肝、肺、腎臟后未見(jiàn)明顯異常,考慮為死亡為化療后毒副作用所致。其余各組一般狀況良好,未見(jiàn)藥物不良反應(yīng)。經(jīng)過(guò)4 周治療后,各組裸鼠平均體重:清熱利濕外治法高劑量組(18.83±0.76)g,清熱利濕外治法中劑量組(18.45±0.65)g,清熱利濕外治法低劑量組(18.72±0.82)g,順鉑組(13.51±0.31)g,對(duì)照組(19.26±0.82)g,順鉑組與其余各組相比,裸鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05),清熱利濕外治法3 個(gè)劑量組與空白對(duì)照組體質(zhì)量無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表1。

        3.3 各處理組裸鼠腫瘤體積變化 接種宮頸癌Siha 細(xì)胞后各組腫瘤體積均逐漸增大,對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)較快,各治療組移植瘤體積均小于對(duì)照組,其中清熱利濕外治法高、中劑量組及順鉑組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。清熱利濕外治法低劑量組腫瘤體積與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

        3.4 各治療組裸鼠瘤重及腫瘤生長(zhǎng)抑制率的比較 順鉑組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為75.82 3%,清熱利濕外治法低、中、高劑量組抑制裸鼠Siha 皮下移植瘤的抑制率分別為14.94%、31.24%、36.23%,見(jiàn)表1。在治療終點(diǎn),順鉑組及紫柏凝膠高、中劑量組瘤重與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而清熱利濕外治法低劑量組瘤重與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

        表1 各組裸鼠質(zhì)量、瘤體積、瘤重、抑制率變化()

        表1 各組裸鼠質(zhì)量、瘤體積、瘤重、抑制率變化()

        組別 裸鼠質(zhì)量(g)瘤體積(cm3)瘤重(g)抑制率(%)外治法高劑量組 18.83±0.76 1.918±0.82# 1.727 5±0.63# 36.23外治法中劑量組 18.45±0.65 1.935±0.83# 1.813 1±0.74# 31.24外治法低劑量組 18.72±0.82 2.280±0.85 2.304 2±0.81 14.94順鉑組13.51±0.31 1.040±0.41# 0.655 0±0.14# 75.82空白對(duì)照組19.26±0.82 2.640±0.95 2.709 0±0.63

        3.5 裸鼠移植瘤組織的病理學(xué)觀察 肉眼觀察各組裸鼠移植瘤組織呈結(jié)節(jié)狀,腫瘤組織血供明顯、豐富,組織切面呈魚(yú)肉樣,可見(jiàn)局灶性壞死,以順鉑組及外用中藥方高劑量治療組明顯。鏡下見(jiàn)各組腫瘤細(xì)胞呈圓形或卵圓形,腫瘤細(xì)胞核大且清晰,可見(jiàn)病理性核分裂,腫瘤細(xì)胞呈漩渦、簇團(tuán)狀生長(zhǎng),瘤團(tuán)間可見(jiàn)壞死病灶形成,呈均質(zhì)紅染色樣,細(xì)胞變大,細(xì)胞核染色加深,見(jiàn)核固縮、溶解、碎裂。各治療組的腫瘤組織壞死區(qū)域均有增大,其中順鉑組壞死區(qū)域增大較為明顯。外用中藥方用藥組隨著治療劑量的增高,腫瘤組織壞死區(qū)域呈逐漸增大趨勢(shì)。

        3.6 清熱利濕外治法對(duì)p-ERK 蛋白表達(dá)的影響 從表2 可見(jiàn),各用藥治療組與空白對(duì)照組相比較,p-ERK 蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降,其中外用中藥方高劑量組、中劑量組及順鉑組與空白對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示外用中藥方有下調(diào)p-ERK 蛋白表達(dá)的作用。

        3.7 清熱利濕外治法對(duì)p-p38 蛋白表達(dá)的影響 從表2 可見(jiàn),各用藥治療組與空白對(duì)照組相比較,p-p38 蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降,其中外用中藥方高劑量組、中劑量組及順鉑組與空白對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示外用中藥方有下調(diào)p-p38 蛋白表達(dá)的作用。

        圖2 各組裸鼠大體情況

        圖3 各組裸鼠移植瘤組織病理學(xué)觀察(×200)

        圖4 各組裸鼠移植瘤組織p-ERK 蛋白表達(dá)情況(×200)

        圖5 各組裸鼠移植瘤組織p-p38 蛋白表達(dá)情況(×200)

        表2 清熱利濕外治法對(duì)p-ERK、p-p38 蛋白表達(dá)的影響

        4 討論

        清熱利濕外治法全方由紫草、金銀花、苦參、黃柏、百部、莪術(shù)、白芨等藥物組成,以上中藥采用水提、醇提法提取后,加用卡波姆等基質(zhì)制作而成,全方具有清熱祛濕、解毒活血、斂瘡生肌、殺蟲(chóng)止癢之功效。該方由東直門(mén)醫(yī)院名老中醫(yī)郭志強(qiáng)教授創(chuàng)立,該方經(jīng)過(guò)前期部分臨床觀察,用于治療宮頸高危型HPV 感染,療效甚佳。前期清熱利濕體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果亦證實(shí)此法能抑制宮頸癌Siha 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡[10]。

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人宮頸Siha 細(xì)胞癌的動(dòng)物研究,發(fā)現(xiàn)清熱利濕外治法降低了人宮頸Siha 細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)。我們通過(guò)建立人宮頸癌Siha 細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型,研究高、中、低劑量的清熱利濕外治法治療腫瘤效果,實(shí)驗(yàn)中采用模型組作為陰性對(duì)照,以細(xì)胞毒性藥物順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照比較,結(jié)果顯示清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用。高、中、低濃度組的清熱利濕外治法的腫瘤抑制率分別為36.23%、31.24%、14.94%,抑瘤效果呈劑量依賴性,隨之外治法治療劑量的增加,抑瘤效果增強(qiáng)。治療期間荷瘤裸鼠無(wú)進(jìn)食水量減少、消瘦、行動(dòng)遲緩等副反應(yīng)表現(xiàn),顯示外治方藥物安全性高并無(wú)毒副作用。HE 染色病理檢查發(fā)現(xiàn),隨著外治方治療劑量增加,瘤團(tuán)間的壞死灶比例增大。本研究結(jié)果顯示,外治法對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。

        ERK 及P38 是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員,參與并調(diào)節(jié)了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂及死亡等多種生理過(guò)程,并且在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。目前,ERK 及P38 是腫瘤發(fā)展和防治研究的重要熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,清熱利濕外治法在一定劑量范圍內(nèi)可以下調(diào)p-ERK 及p-P38 蛋白表達(dá)水平,說(shuō)明清熱利濕外治法可以通過(guò)下調(diào)ERK/P38 MAPK 信號(hào)通路引起細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而阻滯宮頸癌細(xì)胞增殖,且清熱利濕外治法對(duì)ERK/P38 MAPK 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)點(diǎn)應(yīng)該在上游,具體調(diào)節(jié)點(diǎn)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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