儲娜，孫會東，周敬如，傅華英，李曉燕，高三基

（福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

0 引言

甘蔗（Saccharumspp.）是中國乃至全球重要的糖料作物，甘蔗糖分別占我國和全球食糖總量的90%[1]和80%[2]。甘蔗除了制糖，還可以生產(chǎn)燃料乙醇、制作青貯飼料，制糖副產(chǎn)品還可以進行高值化、資源化為目的的多元化利用。甘蔗病害種類至少有130 多種，我國有記載的病害至少50 余種[3]。甘蔗細菌性病害主要有由燕麥食酸菌燕麥亞種[Acidovorax avenuesubsp.avenae（Aaa）]引起的赤條病，由木質(zhì)部賴氏菌木質(zhì)部亞種（Leifsonia xylisubsp.xyli）引起的宿根矮化病，由白條黃單胞桿菌（Xanthomonas albilineans）引起的白條病和由地毯草流膠病黃單胞桿菌（X.vasicolapv.vasculorum）引起的流膠病[4-5]。其中，甘蔗赤條病是一種全球普遍發(fā)生的病害，其葉條斑型對甘蔗生產(chǎn)不會造成嚴重影響，但是該病害頂腐型會引起植株死亡，對甘蔗及其蔗糖產(chǎn)業(yè)造成嚴重損失。本文擬從甘蔗赤條病基本情況及其致病菌的生物學基本特性和分子生物學基礎研究等方面內(nèi)容進行綜述，并對該病害的生態(tài)防控和今后的研究重點進行探討，以期為甘蔗赤條病的有效防控提供參考。

1 甘蔗赤條病基本情況

1.1 病害發(fā)生與危害

早在1895 年阿根廷報道的一種眾所周知的“Polvillo”病害，可能是甘蔗赤條病。上世紀20 年代美國夏威夷將這種病害癥狀描述為紅色條斑，命名為細菌性紅色條斑病，其病菌最早于1925年由Lee和Martin分離獲得，并通過接種鑒定證實[6]。該病害在澳大利亞、美國、古巴、阿根廷、巴基斯坦等50 多個國家或地區(qū)均有發(fā)生[7]。近年來，該病害在阿根廷蔗區(qū)暴發(fā)，造成甘蔗經(jīng)濟損失30%[4]。上世紀80 年代在我國廣東、廣西、福建、海南、臺灣等省份也有甘蔗赤條病發(fā)生，有的蔗區(qū)田間自然發(fā)病率高達到60%[8]。最近，云南省元江縣蔗區(qū)也出現(xiàn)了甘蔗赤條病[9]。我國蔗區(qū)赤條病幾乎每年都有發(fā)生，引起甘蔗減產(chǎn)、品質(zhì)下降[10]。

1.2 病害典型癥狀

甘蔗赤條病的癥狀有兩種類型：葉條斑和頂腐，兩者可以單獨發(fā)生，也可同時發(fā)生[6-8]。葉條斑型：癥狀一般多發(fā)生于嫩葉葉片中部，靠近中脈部位，最初表現(xiàn)為水漬狀褪綠條紋，隨后向兩端迅速擴展成長條狀紅色至紅褐色病斑。葉片條斑的發(fā)病組織與健康組織有明顯的界限，寬度為0.5～4 mm，長幾十毫米至葉片全長。有時2條或多條條斑連接成帶狀，某些品種可延伸至葉鞘。在葉片下表皮病斑上，常?？梢姷揭粚颖”》勰畹募毦绯鑫铩Ｔ诤涓稍锏臈l件下，條斑的邊緣具有黃暈，以后條斑彼此組合成赤條與黃暈相間的寬帶。頂腐型：植株表現(xiàn)為老葉黃化、枯萎，其早期癥狀是甘蔗生長點附近的維管束變紅、腐爛，進一步發(fā)展，導致節(jié)間大腔穴的形成，后期心葉腐爛，可以從外面包著的葉鞘中拉出來，并具有一種特殊的難聞臭味。嚴重發(fā)病的頂腐型植株蔗莖內(nèi)部組織從上往下腐爛，直至基部，甘蔗生長受到抑制，一般枯死。有時植株蔗莖最上部的一些芽會長出側(cè)枝，這些側(cè)枝上的葉片可能表現(xiàn)出葉條斑型的癥狀。嚴重發(fā)病的蔗莖，芽一般發(fā)生腐爛，即使沒有腐爛，蔗種長出的幼苗也容易死亡[8]。

1.3 寄主范圍

燕麥食酸菌屬細菌能侵染許多重要的單子葉和雙子葉植物[11-12]。燕麥食酸菌燕麥亞種屬于食酸菌屬（Acidovorax）的一個亞種，其自然寄主范圍有甘蔗、高粱、玉米、燕麥、黍和狐尾草等一些禾本科植物[6]，此外，還有水稻[13]、大鶴望蘭（Strelitzia nicolai）[14]、匍匐翦股穎（Agrostis stoloniferaL.）[11]和美人蕉（Cannasp.）[15]。食酸菌屬還有兩個亞種，即燕麥食酸菌西瓜亞種（A.avenuesubsp.citrulli），主要侵染西瓜和葫蘆科植物；燕麥食酸菌卡特蘭亞種（A.avenuesubsp.cattleyae），只侵染卡特蘭和蝴蝶蘭[12]。

1.4 傳播途徑與病害循環(huán)

甘蔗赤條病在田間主要靠風、雨傳播，通過蔗種、機械途徑傳播的可能性很小，昆蟲可傳播病菌，但不是主要的傳播媒介[6,8]。在潮濕溫暖的條件下容易發(fā)病，一般5～7 d 便可產(chǎn)生典型癥狀。甘蔗赤條病病原菌從葉片上、下表皮的氣孔和傷痕處侵入，并在入口處薄壁組織的細胞間隙大量繁殖，然后侵入維管束中的各組織，特別是導管更容易充滿病菌，并在導管中縱向蔓延。病葉的傷痕表面常有細菌溢泌物，可借助雨水和氣流，在植株個體間、田塊間傳播。在病害侵染循環(huán)中，田間帶病菌的殘葉或者中間寄主雜草是病害的初侵染源。病原菌可以在土壤中存活32 d，在患病的枯老蔗葉、蔗莖中經(jīng)4個月后仍然有致病力[8]。

2 病原菌生物學基本特性

2.1 病原菌分類地位

甘蔗赤條病最開始被認為是由紅條紋假單胞菌（Pseudomonas rubrilineansStapp）引起[6]，隨后，Willems等[16]將它重新命名為食酸菌屬（Acidovorax）燕麥食酸菌燕麥亞種。食酸菌屬（Acidovorax）最早由Willems等[17]提出，他根據(jù)細菌的DNA/rRNA 和DNA/DNA 雜交、生化指標、生長培養(yǎng)特性、脂肪酸圖譜以及全細胞蛋白質(zhì)聚丙酰胺凝膠電泳等結(jié)果，將假單胞菌屬（Pseudomonass）的敏捷假單胞菌（P.facilis）和德氏假單胞菌（P.delafieldii）以及一些假單胞菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）等株系分出另立為食酸菌屬，包括了敏捷食酸菌（A.facilis）、德氏食酸菌（A.delafieldii）和中等（溫和）食酸菌（A.temperans）。隨后，Willems 等人[16]還將假單胞菌燕麥假單胞菌（P.avenae）和魔芋假單胞菌（P.konjaci）移入食酸菌屬，分別稱為燕麥食酸菌種和魔芋食酸菌（A.konjaci），同時，提出燕麥食酸菌種包括燕麥食酸菌燕麥亞種、燕麥食酸菌卡特萊亞種和燕麥食酸菌西瓜亞種。然而，Schaad等[18]對該屬提出修訂，建議將燕麥食酸菌卡特萊亞種和燕麥食酸菌西瓜亞種應該定義為細菌種，并增加水稻食酸菌（A.oryzae）為一個新的進化分支。

根據(jù)2015 年Wiley 出版社和伯杰氏手冊基金會聯(lián)合出版的《伯杰古細菌和細菌分類手冊》描述，食酸菌屬包含7 個種和3 個亞種，代表種為敏捷食酸菌。根據(jù)食酸菌屬進化分類地位可以分為兩組，一組包含敏捷食酸菌、德氏食酸菌、德弗食酸菌（A.defluvii）和中等食酸菌，這些存在于土壤、水和臨床的分離物中；另一組包括對植物有致病力的燕麥食酸菌、魔芋食酸菌和花燭食酸菌（A.anthurii）[12]。

2.2 病原菌形態(tài)特征及生長條件

燕麥食酸菌燕麥亞種屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，單菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓形、半透明、淺黃色，菌落直徑大小約2～3 mm；菌落低凸、濕潤光滑、邊緣纓邊形或圓鋸齒狀[6]。該菌細胞形態(tài)為短桿狀，末端圓鈍，1.60μm×0.70μm，具有單極鞭毛，偶爾有2～3 根單極鞭毛，能游動，單生，偶有串成鏈狀，不形成芽孢，無隔膜[6]。在30℃的培養(yǎng)條件下，第3天菌落直徑達到0.5～3 mm，第7天菌落直徑達到4 mm。燕麥食酸菌大多數(shù)菌種在營養(yǎng)瓊脂上不產(chǎn)生色素，但是一些植物病原菌株可以產(chǎn)生黃色至微褐色的可擴散性色素[16,19]。在培養(yǎng)基上，此菌的生長溫度范圍為30℃～35℃[12]，致死溫度為51℃～52℃[8]。

2.3 甘蔗赤條病菌基因組特性

目前，美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫公布的燕麥食酸菌燕麥亞種基因組序列共有18條，其中模式菌株ATCC 19860 具有完成圖，另外17 個株系基因組僅為框架圖或精細圖[20-22]，以上這些菌株的基因組序列大小為5.48～5.75 Mb，GC 含量為59.9%～68.8%，預測編碼基因有2 659～5 118 個，已注釋蛋白為2 542～4 706個。Fontana等[21]對侵染甘蔗的燕麥食酸菌燕麥亞種菌株T10_61進行了基因組測序和序列分析，結(jié)果顯示基因組序列為有5.65 Mb，GC含量為68.7%，編碼大約5 096 個基因，已注釋蛋白為4 829個，編碼58個tRNA；該菌株染色體上有3個rRNA操縱子和43個tRNA。

3 病原鑒定與檢測

通過田間癥狀來診斷甘蔗赤條病容易造成誤診，因為由紅蒼白草螺菌（Herbaspirillum rubrisubalbicans）[23]、黃單胞桿菌（Xanthomonassp.）[4,24]、鏈格孢菌（Alternariasp.）[25]也會引起甘蔗葉片出現(xiàn)紅色或紅褐色的條紋，類似甘蔗赤條病葉條斑癥狀。病害診斷還可以通過病原形態(tài)電鏡觀察、生化測試、血清學反應以及多種分子檢測方法。常規(guī)PCR、巢式PCR、熒光定量PCR 等技術(shù)已應用于該病害檢測。Zia-ul-Hussnain 等[26]從巴基斯坦甘蔗赤條病病株上分離得到了Aaa病菌，并分析了該病菌的菌體形態(tài)、培養(yǎng)條件和生理生化特性。Song 等[27]建立病菌生物學培養(yǎng)和巢式PCR 相結(jié)合的BIO-PCR 方法，對64 份水稻種子Aaa病菌進行檢測，比常規(guī)PCR 檢出率高出29.7%。Fontana 等[4]利用靶向燕麥食酸菌的ITS 區(qū)域引物（Oaf1 和Oar1）和靶向細菌16S rRNA 通用引物（Plb/Mlb和P0f/P6r）對甘蔗赤條病樣品進行常規(guī)PCR檢測。我們課題組根據(jù)燕麥食酸菌燕麥亞種ITS區(qū)域設計一套巢式檢測引物對國內(nèi)甘蔗赤條病樣品也開展病害Aaa檢測[28]，隨后，利用內(nèi)測引物（RSD-ITS-F1 和RSD-ITS-R1）對84份有疑似赤條病癥狀的樣品和24份無癥狀的樣品分別進行常規(guī)PCR 檢測，檢出率為96%和83%[1]。此外，還開發(fā)了一套TaqMan 探針實時熒光定量PCR 快速、準確、靈敏的檢測方法，檢測靈敏度達100 拷貝[29]。有關(guān)環(huán)介導等溫擴增反應（LAMP）檢測技術(shù)在甘蔗赤條病上的應用未見報道[30]。

4 病原菌遺傳變異

關(guān)于侵染甘蔗的Aaa遺傳多樣性研究報道較少。Fontana 等[4]利用RAPD-PCR 技術(shù)分析了39 個來自阿根廷的甘蔗赤條病菌的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些分離物具有豐富的DNA 多態(tài)性圖譜，可分成4 種不同的類群，與分離物的地理來源有一定的相關(guān)性。最近，F(xiàn)ontana 等人[31]采用多位點序列分型技術(shù)（Multilocus sequence typing,MLST）進一步研究阿根廷甘蔗赤條病菌的遺傳多樣性，來自4 個阿根廷蔗區(qū)的15 種株系存在5種核苷酸序列類型?；?42條甘蔗赤條病菌的ITS間隔區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，我國蔗區(qū)甘蔗赤條病菌株系序列存在高度的遺傳多樣性，ITS 間隔區(qū)序列長度存在明顯的差異，主要是由于不同的插入/缺失（InDel）所致；這些分離物序列存在7種類型[1]。

5 燕麥食酸菌致病機理

目前有關(guān)于燕麥食酸菌種的致病機理研究報道較少，國內(nèi)學者對水稻細菌性褐條病的病原菌水稻食酸菌致病機理有了系統(tǒng)研究。Liu 等[32]通過蛋白質(zhì)譜分析并結(jié)合生物信息學方法，探究水稻食酸菌RS-1 株系的致病機理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了病原菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)影響其致病性。劉賀[33]進一步研究該病原菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的某些基因功能，發(fā)現(xiàn)icFm和dotU基因的缺失突變會導致水稻食酸菌RS-1 株系致病能力大大下降，而且icFm和dotU之間存在相互作用；另外，還發(fā)現(xiàn)病原菌菌毛中的重要基因pilp在其致病性、游動能力、菌毛形成和生物膜形成等方面也發(fā)揮重要作用。當pilp基因缺失后，細菌喪失菌圈和Ⅳ型菌毛，但是，當該基因回補到突變菌體時，細菌再次形成暈圈，再次長出菌毛。Masum 等[34]通過基因片段插入、缺失和互補分析方法研究Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）對水稻食酸菌RS-2株系的致病性，并使用同源重組法構(gòu)建25 個T6SS突變體與野生型（RS-2）之間進行毒力比較，結(jié)果顯示，有15個T6SS基因突變體顯著降低了細菌的毒力以及減少了HCP 蛋白的分泌，表明T6SS 在菌株RS-2 的毒力中起著重要作用，主要原因可能是由于HCP 蛋白分泌減少和生物膜的形成等因素導致。

Brigida 等[35]基于轉(zhuǎn)錄組水平分析甘蔗響應Aaa的分子機制，結(jié)果表明，在受Aaa侵染的轉(zhuǎn)錄本中，共有789 個不同的轉(zhuǎn)錄本，其中有723 個被注釋，對應467 個基因；將獲得的差異基因通過GO 和KEGG 富集分析顯示這些基因參與了幾種代謝途徑，如蛋白質(zhì)編碼的應激反應、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程、氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等；同時，在ET 和JA-PRR 生物合成途徑中的基因、氧化爆裂基因、NBS-LRR基因、細胞壁強化基因、SAR誘導基因和致病相關(guān)基因（PR）顯著上調(diào)，因此這些基因都有可能積極參與甘蔗響應Aaa侵染的防御作用。

6 甘蔗赤條病防控技術(shù)

選育和推廣甘蔗抗病品種是甘蔗赤條病防控最經(jīng)濟、最有效的措施，也是一種綠色生態(tài)防控技術(shù)[6-8]。我國蔗區(qū)目前種植的甘蔗品種新臺糖16 號、新臺糖25 號、粵糖93-159、粵糖00-236、桂糖94-116、桂引5 號、云蔗03-194 在自然條件下有發(fā)病的現(xiàn)象，但是他們的抗病性需要進一步接種鑒定[9,36]，通過田間的調(diào)查研究以及赤條病的接種實驗發(fā)現(xiàn)云蔗03-194 和閩糖11-610 為感病品種，福農(nóng)38、福農(nóng)39、桂糖29、桂糖31、粵糖60、粵糖55、云蔗05-51、柳城05-136、新臺糖20號、新臺糖22號等為抗病品種。

另外，還要采取多種農(nóng)業(yè)防治措施進行綜合防控甘蔗赤條病。如：搞好農(nóng)田基本建設，建立合理的排灌系統(tǒng)；及時清除蔗田病株病葉，最好堆肥或集中燒毀，減少病害侵染源；適當增施磷、鉀肥，促使植株健壯，增強抗病能力，降低發(fā)病率?；瘜W藥劑防治也是有效控制甘蔗赤條病發(fā)生和流行的重要技術(shù)措施。在甘蔗赤條病發(fā)病初期，可用72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑750～1 000倍液或50%代森鋅1 000 倍稀釋液噴霧，每周一次，連續(xù)噴2～3次[36]。

7 展望

甘蔗是我國主要的糖料作物，是影響我國國計民生的四大農(nóng)產(chǎn)品之一，廣西和云南1 Mhm2（1 500 萬畝）蔗區(qū)已列入國家重要農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)保護區(qū)[37]。目前我國甘蔗赤條病在國內(nèi)各主要蔗區(qū)有零星發(fā)生，個別種植感病品種的田塊發(fā)生率較高，該病害的綜合防控應該引起重視。加快甘蔗抗病育種的進程，選育高產(chǎn)高糖抗病甘蔗新品種，為蔗區(qū)甘蔗品種多系布局提供依據(jù)；加強甘蔗野生種質(zhì)抗性基因的挖掘，拓寬國內(nèi)的甘蔗親本雜交遺傳基礎，通過有性雜交導入抗性遺傳物質(zhì)也值得深入探索。有報道甘蔗印度種、中國種種質(zhì)材料比較抗病[1,8]。雖然近年來有關(guān)甘蔗赤條病的病原分離鑒定、分子檢測以及致病菌的遺傳多樣性已有報道，但是有關(guān)甘蔗赤條病菌的致病機理及其與寄主的分子互作機制尚不清楚。隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，容易獲得細菌全基因組的序列信息，可以在結(jié)構(gòu)基因組學、比較基因組學層面上，通過生信分析技術(shù)和手段探究細菌的耐藥性、毒力因子、代謝系統(tǒng)、環(huán)境適應性、進化與演變歷程等。也可以開展病原菌侵染后的甘蔗轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等多組學聯(lián)合分析技術(shù)，探索甘蔗赤條病菌生態(tài)適應性、致病性基因的分子進化規(guī)律、病原菌的致病分子機理等基礎理論研究。