徐少杰，李興吟，孫 軍，袁 萍

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430030

由于腫瘤的遺傳多樣性和異質(zhì)性，當(dāng)前腫瘤的靶向治療和免疫治療的效果仍不理想，因此，腫瘤依舊是當(dāng)今社會威脅人類生命安全最危險(xiǎn)的因素之一。凋亡素是一種由雞貧血病毒(CAV)基因VP3編碼而來的非結(jié)構(gòu)性小分子蛋白，通過靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤的功能。近年來，越來越多的科研人員參與到這一領(lǐng)域的研究并進(jìn)一步闡明了凋亡素抗腫瘤的分子機(jī)制。本文將詳細(xì)綜述近年來凋亡素在誘導(dǎo)腫瘤凋亡方面的研究進(jìn)展。

1 凋亡素概述

CAV是一種單鏈DNA病毒，屬于環(huán)病毒屬[1]，其基因組包含3個(gè)完全或部分重疊的開放閱讀框，分別編碼VP1、VP2和VP3病毒蛋白，其中VP3病毒蛋白能夠激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號從而誘導(dǎo)凋亡，因此被命名為凋亡素[2-3]。凋亡素是一種14 kD的小分子蛋白，富含絲氨酸和蘇氨酸等堿性氨基酸[3]，包括2段核定位信號序列(NLS)和1段核輸出信號序列(NES)[4-6]，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘蛲鏊剡M(jìn)行核穿梭運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要。許多研究已經(jīng)證明凋亡素在腫瘤細(xì)胞中能夠與多種蛋白相互作用[1]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤的作用。自20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)凋亡素以來[7]，由于其具有能夠誘導(dǎo)多種人類腫瘤細(xì)胞凋亡，而不會對正常細(xì)胞產(chǎn)生傷害的特點(diǎn)[8-9]，研究人員希望以此為靶點(diǎn)開發(fā)新的、特異性的抗腫瘤治療方法，這引起了腫瘤研究者的極大興趣。

2 凋亡素與腫瘤

腫瘤的形成是由于體內(nèi)外環(huán)境刺激而引起的機(jī)體遺傳物質(zhì)發(fā)生改變并積累的多因素、多階段的過程，腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)出生長失控、存活率提高、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)以及代謝模式改變等惡性特征[10-11]。近年來，人們不斷探索著抗腫瘤治療的分子靶標(biāo)藥物和方法，而凋亡素作為一種靶標(biāo)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的蛋白引起了科研工作者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在人類常見的十幾種惡性腫瘤中，例如乳腺癌、肝癌、肺癌及膠質(zhì)瘤，凋亡素都能夠有效地發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞存活的功能[6-7，12]。

2.1 乳腺癌

乳腺癌是當(dāng)今社會女性群體中最常見的且對生命有嚴(yán)重威脅的惡性腫瘤[13]，盡管近年來在腫瘤的診療方面取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但由于各個(gè)地區(qū)人類種族、地理環(huán)境以及飲食習(xí)慣等因素的差異，在全球范圍內(nèi)，仍有許多國家和地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率處于較高的水平[14-15]。Nastasie等[16]的研究發(fā)現(xiàn)凋亡素的腫瘤細(xì)胞核靶向信號(tNTS)在誘導(dǎo)乳腺腫瘤凋亡的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，首次使用人類乳腺腫瘤進(jìn)展模型證明凋亡素tNTS在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞核中累積水平明顯提高，并且tNTS序列能夠賦予攜帶該序列的融合組蛋白H3和H2B腫瘤特異性的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，對未來利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為基因/藥物傳遞的載體方，這一應(yīng)用具有重要意義。Hou和Chen等[17-18]的研究表明不管是重組凋亡素蛋白，還是病毒載體表達(dá)的凋亡素蛋白，都能夠誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞的凋亡，且在這個(gè)過程中均表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。

2.2 肝癌

原發(fā)性肝癌在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食管癌而居第3位，在部分地區(qū)的農(nóng)村中則占第2位，僅次于胃癌[19]。據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，肝細(xì)胞癌占所有原發(fā)性肝癌的90%以上，是一個(gè)重大的國際健康問題[19-20]。而凋亡素作為一種潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，能夠有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。綜合近年來凋亡素在肝癌方向的研究發(fā)現(xiàn)，科研人員希望通過基因載體的方法，在肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡素表達(dá)，以研究其對肝癌細(xì)胞的影響[21-22]。Bae和Zhang等[9，23]通過病毒或者非病毒基因載體的方法，誘導(dǎo)凋亡素基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示，外源導(dǎo)入的凋亡素能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的生長，并誘導(dǎo)其凋亡，在裸鼠荷瘤模型中，同樣出現(xiàn)了這一現(xiàn)象。

2.3 肺癌

到目前為止，肺癌仍然是世界上腫瘤引起死亡的主要原因之一。由于肺癌在化療過程中常產(chǎn)生耐藥性，極大地限制了化療的治療效果，因此，急需尋找一種解決腫瘤細(xì)胞化療過程中產(chǎn)生耐藥性的方法[24-25]。Du和Jin等[26-27]發(fā)現(xiàn)，將過表達(dá)凋亡素的基因治療載體應(yīng)用于肺癌細(xì)胞中，其能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。聯(lián)合化療藥物順鉑處理細(xì)胞時(shí)，具有協(xié)同作用，可抑制腫瘤生長，提高模型小鼠的生存率。

2.4 膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤起源于膠質(zhì)細(xì)胞，是成年人中最常見且最具侵襲性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率表現(xiàn)出逐年上升的趨勢，特別是在醫(yī)療和衛(wèi)生水平相對落后的發(fā)展中國家[28-29]。近年來，科研人員通過對凋亡素或其衍生物在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中功能的研究，希望能探尋一種新的膠質(zhì)瘤臨床應(yīng)用藥物。Song和Bae等[30-31]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，凋亡素及其衍生物能夠靶向抑制AKT的磷酸化和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)水平，另外這些成分還能有效激活Caspas-3凋亡信號通路[32]，從而降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，提高凋亡率；在原位侵襲性膠質(zhì)瘤小鼠模型中，凋亡素或者其衍生物在降低腫瘤的生長能力和延長小鼠生存期方面同樣發(fā)揮著積極作用[30，33]。Zhong和Bae等[33-34]研究者通過表達(dá)載體在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡素表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)其能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GBL-14和U87MG的凋亡。

以上研究表明，凋亡素是一種有效且廣譜的腫瘤細(xì)胞殺傷蛋白，在多種腫瘤中能夠特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。盡管許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明凋亡素的腫瘤特異性殺傷效應(yīng)，但這其中的確切分子機(jī)制仍不夠清晰。

3 凋亡素的腫瘤特異性核易位

凋亡素是一種能夠靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而不會對正常細(xì)胞產(chǎn)生傷害的小分子量蛋白[7]。臨床前動(dòng)物模型的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)也表明，凋亡素具有有效的腫瘤抑制功能，并且表現(xiàn)出極低的生物毒性[3]，這主要是由于凋亡素在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中，通常會被腫瘤細(xì)胞中相關(guān)的信號蛋白激活，導(dǎo)致其在核中積累，而在正常細(xì)胞中則停留在細(xì)胞質(zhì)中。闡明凋亡素在腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程中與之相互作用的蛋白及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將有助于凋亡素介導(dǎo)的靶向腫瘤治療的進(jìn)展。

3.1 細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1/2(Chk1和Chk2)

在細(xì)胞周期的進(jìn)程中，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白儲備和遺傳物質(zhì)的完整性對細(xì)胞周期的正常進(jìn)行至關(guān)重要，因此需要每個(gè)檢查點(diǎn)的“監(jiān)管者”盡忠職守。在G2/M期的進(jìn)程中，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1/2能夠精準(zhǔn)地檢測這一過程中的DNA損傷，發(fā)揮其“監(jiān)管者”的職責(zé)，通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA損傷修復(fù)或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持生物遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和細(xì)胞生命進(jìn)程正常進(jìn)行[35-36]。Kucharski等[8]的研究發(fā)現(xiàn)凋亡素能夠通過與細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1/2相互作用，導(dǎo)致凋亡素鄰近N末端的NES基序的2個(gè)蘇氨酸殘基(T56和T61)發(fā)生磷酸化，使其細(xì)胞定位發(fā)生改變，作為一種DNA損傷信號的“傳感器”，引起腫瘤細(xì)胞凋亡。又有研究表明腫瘤細(xì)胞具有更高的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶活性和較高的DNA損傷修復(fù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力[37]。因此，在腫瘤細(xì)胞中，通過誘導(dǎo)凋亡素的第56和第61這2個(gè)位點(diǎn)的蘇氨酸殘基磷酸化，能夠有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這為凋亡素選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且不會對正常細(xì)胞產(chǎn)生傷害給出了合理的解釋，并為腫瘤的治療提供了一個(gè)具有前景的生物分子靶點(diǎn)。

3.2 蛋白激酶C(PKC)

絲氨酸-蘇氨酸激酶家族在細(xì)胞周期和分化、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞存活和死亡的過程中發(fā)揮一定作用，但是不同家族成員的表達(dá)水平以及亞細(xì)胞定位各不相同，導(dǎo)致各成員之間的生物學(xué)功能差異巨大[38-39]。許多研究表明絲氨酸-蘇氨酸激酶家族中的重要成員蛋白激酶C的激活對于誘導(dǎo)細(xì)胞活化、增殖、運(yùn)動(dòng)和存活是必不可少的[39]。因此在腫瘤研究領(lǐng)域中，蛋白激酶C受到了越來越多的科研工作者的注意。Bullenkamp等[40]的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，蛋白激酶C的表達(dá)水平與凋亡素的活性相關(guān)并且二者主要在核中發(fā)生相互作用。機(jī)制研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，高水平表達(dá)的蛋白激酶CβⅠ作用于凋亡素的蘇氨酸殘基(T108)，凋亡素NLS基序被磷酸化而與其受體的親和力增強(qiáng)，導(dǎo)致凋亡素在細(xì)胞核中累積，并引起蛋白激酶C的活化，從而激活蛋白激酶CβⅠ介導(dǎo)的凋亡素磷酸化，促進(jìn)腫瘤特異性的核易位并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于在正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞中蛋白激酶CβⅠ的表達(dá)水平較低，因此上述正反饋通路無法激活，在正常細(xì)胞中凋亡素不會引起細(xì)胞死亡。Jiang等[41]在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的研究表明，在眾多的蛋白激酶中，只有蛋白激酶Cβ與凋亡素相互作用，并且進(jìn)一步闡明，通過凋亡素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的蛋白激酶Cβ以蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡素與蛋白激酶Cβ在腫瘤細(xì)胞中相互協(xié)調(diào)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究，為臨床應(yīng)用凋亡素靶向治療腫瘤提供了理論支撐。

腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Chk1/2和PKC等蛋白作用于凋亡素NES和NLS序列，引起腫瘤細(xì)胞的特異性磷酸化水平升高，促使凋亡素核穿梭并定位于細(xì)胞核，而在正常細(xì)胞中則保持低磷酸化狀態(tài)，為凋亡素的腫瘤細(xì)胞特異性核定位提供了一種新的機(jī)制。

4 凋亡素誘導(dǎo)凋亡的信號通路

在腫瘤細(xì)胞中，凋亡素被磷酸化，然后易位到細(xì)胞核中，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，與凋亡素結(jié)合的異種NLS迫使其進(jìn)入正常細(xì)胞的細(xì)胞核并不會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率的提升，表明單純的核定位并不能使凋亡素在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[42]。因此，除了核定位外，凋亡素的激活還需要一個(gè)或多個(gè)額外的事件。闡明凋亡素發(fā)揮效應(yīng)可能的信號通路，是探究凋亡素誘導(dǎo)凋亡全過程必不可少的一部分。

4.1 線粒體凋亡途徑

在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，Caspase家族作為關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)揮重要作用，其家族中的一員半胱天冬酶-3是常被激活的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶，通過催化許多關(guān)鍵蛋白的特異性裂解，在細(xì)胞程序性死亡的進(jìn)程中發(fā)揮著重要功能[43-44]。半胱天冬酶-3與凋亡素對細(xì)胞命運(yùn)的影響非常相似，從而引起了科研人員對兩者在腫瘤細(xì)胞凋亡領(lǐng)域的研究興趣。先前對凋亡素誘導(dǎo)凋亡的研究方法，通常是將凋亡素通過病毒載體以核苷酸的形式直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者以重組蛋白的形式直接孵育細(xì)胞，而在動(dòng)物模型中則通常將攜帶凋亡素基因的病毒載體或者重組蛋白直接注射入體內(nèi)。然而，由于凋亡素半衰期短和細(xì)胞或動(dòng)物模型最大耐受劑量的限制，這些處理方式可能達(dá)不到有效濃度或者導(dǎo)致細(xì)胞或動(dòng)物模型發(fā)生排斥反應(yīng)，以致無法得到正確的結(jié)論[45-46]。而Du等[26]通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)將凋亡素有效地轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，使其成功合成并分泌凋亡素，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并且通過動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)了自主分泌凋亡素的間充質(zhì)干細(xì)胞的抗腫瘤作用。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的凋亡素在肺癌細(xì)胞中能夠有效地激活半胱天冬酶-3，導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)凋亡信號。另有研究發(fā)現(xiàn)，Apaf-1缺陷的成纖維細(xì)胞以及缺乏Apaf-1的腫瘤細(xì)胞對凋亡素具有完全抗性，但Caspase-3缺失的MCF-7細(xì)胞系依舊被凋亡素殺死[47]，提示凋亡素誘導(dǎo)的死亡涉及Caspase依賴的線粒體通路，但Caspase-3在凋亡素誘導(dǎo)凋亡中不是必要的，可能被Caspase-6或-7等效代替。

在腫瘤細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中，凋亡素通過凋亡復(fù)合體激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，即通過傳統(tǒng)內(nèi)源性途徑介導(dǎo)凋亡。

Basse等[48]的研究表明，在宮頸癌細(xì)胞系中，抗菌肽(ABPs1)通過與凋亡素聯(lián)合作用，能夠促進(jìn)半胱天冬酶-3活性水平顯著提高，從而激活半胱天冬酶-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這些凋亡素發(fā)揮抗腫瘤功能的傳統(tǒng)機(jī)制，在凋亡素與其他凋亡因子聯(lián)合作用時(shí)依舊成立。

4.2 抑制HSP70介導(dǎo)凋亡

熱休克蛋白是一類在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，其通過防止蛋白質(zhì)聚集和促進(jìn)變性蛋白質(zhì)重新折疊，抵抗由于理化等體內(nèi)外環(huán)境刺激引起的細(xì)胞死亡，Yuan等[49]的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞應(yīng)激刺激條件下，HSP70首先被激活，凋亡素與細(xì)胞質(zhì)中激活的HSP70結(jié)合，并被其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中，凋亡素促進(jìn)HSF1三聚體解聚從而抑制HSF1介導(dǎo)的HSP70轉(zhuǎn)錄。另外，研究發(fā)現(xiàn)HSP70啟動(dòng)子中的HSE能夠被凋亡素與HSF1競爭結(jié)合，從而導(dǎo)致HSP70的轉(zhuǎn)錄水平降低。以上的機(jī)制研究清晰地闡述了凋亡素通過抑制HSP70轉(zhuǎn)錄起始及蛋白表達(dá)水平，從而抵抗HSP70介導(dǎo)的腫瘤凋亡保護(hù)的能力。而Song等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，不僅凋亡素能夠結(jié)合HSP70啟動(dòng)子中HSE的SH3功能域，凋亡素來源的微肽也同樣具有此功能，進(jìn)而抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

HSP70是其中一種廣泛參與抑制線粒體凋亡通路和膜受體凋亡通路的抗凋亡蛋白[50-51]，通過結(jié)合細(xì)胞色素c或Apaf-1抑制凋亡復(fù)合體的形成和對Caspase-3的募集[52]，從而對細(xì)胞凋亡起到抑制作用。推測凋亡素通過靶向抑制HSP70的活性，抑制腫瘤自我保護(hù)的能力，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。惡性細(xì)胞比正常細(xì)胞表達(dá)更高水平的HSP70[51]，也可以解釋凋亡素介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的特異性。

5 總結(jié)與展望

自凋亡素發(fā)現(xiàn)以來，研究人員為探索其選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制而不斷努力。從當(dāng)前的研究分析，我們發(fā)現(xiàn)不僅凋亡素蛋白的C端或N端位置的NLS和NES控制著其腫瘤細(xì)胞特異性的定位和核穿梭[8，53]，而且不同蛋白質(zhì)與其相互作用，同樣影響到凋亡素的定位[4，54]。在細(xì)胞核中凋亡素的異常積累，通常激活線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[55-56]。

近年來，研究人員初步闡明了凋亡素發(fā)揮功能的分子作用機(jī)制，這為其在腫瘤診療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多達(dá)十幾種腫瘤中，凋亡素與相關(guān)蛋白作用能夠有效誘導(dǎo)凋亡進(jìn)程的發(fā)生，引起腫瘤細(xì)胞死亡[1，7]。凋亡素的細(xì)胞毒性機(jī)制與其亞細(xì)胞定位存在極大的關(guān)系，從而發(fā)揮選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，此種特性使其成為腫瘤治療領(lǐng)域的良好“候選物”。

盡管凋亡素在腫瘤治療領(lǐng)域的研究已經(jīng)有很多年的歷史，并且取得了一定成果。然而，凋亡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的確切機(jī)制尚不清楚，正常細(xì)胞中何種物質(zhì)阻斷了凋亡素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?在腫瘤細(xì)胞中是否存在阻斷凋亡素入核或在核中積累的物質(zhì)？這一系列問題仍需要我們不斷探索。以凋亡素為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物或生物分子仍未開發(fā)出來，作為臨床一線治療藥物的應(yīng)用，還有很長的路要走。