胡元森，楊浩杰，謝澳文，韓一鳴，樊 磊，呂揚(yáng)勇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

稻曲菌素(Ustiloxins)是由稻綠核菌產(chǎn)生的一種具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性的環(huán)肽類真菌毒素，該毒素能夠通過抑制微管蛋白的組裝和解聚從而抑制細(xì)胞有絲分裂，對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用；同時(shí)受到稻曲菌素污染的稻谷，質(zhì)量明顯下降[1-3]。由于稻曲菌素對(duì)細(xì)胞的毒性作用，使得其在農(nóng)藥(抗真菌、殺蟲)和醫(yī)藥(抗腫瘤)領(lǐng)域也有廣泛的用途[4-5]。近年來，隨著分離純化技術(shù)的進(jìn)步，不斷有新類型的稻曲菌素被發(fā)現(xiàn)[6-7]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，除稻綠核菌外，糧食儲(chǔ)藏過程中常見的黃曲霉在一定的條件下也能合成稻曲菌素[8-10]。由于該毒素與食品質(zhì)量安全及人類健康的密切關(guān)系，其理化性質(zhì)、毒性、化學(xué)合成、生物合成及其調(diào)控機(jī)理的研究越來越受到重視。作者主要對(duì)稻曲菌素的類型、提取與檢測(cè)方法、生物毒性、生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行綜述。

1 稻曲菌素的類型

截至目前，發(fā)現(xiàn)稻曲菌素共有6種類型，包括A、B、C、D、F、G，均被分離純化并鑒定了結(jié)構(gòu)。其中,稻曲菌素A、B、C、D、F最先被分離鑒定[1-2,6]，而稻曲菌素G在2017年由Wang等[7]從感染稻曲病的大米中分離得到，稻曲菌素G(C的類似物)和之前鑒定的5種毒素有著類似的結(jié)構(gòu)，均具有手性烷基、芳香基醚和13元環(huán)肽的結(jié)構(gòu)。在6種毒素中，稻曲菌素A和B是主要的成分，約占總量的90%[11]。

2 稻曲菌素的提取、分離純化及檢測(cè)

2.1 稻曲菌素的提取與分離純化

呂仕瓊等[5]對(duì)稻曲菌素A、B、C、D、F的提取與分離純化方法做了詳細(xì)的綜述，提取方法主要包括甲醇提取法和硫酸銨沉淀法；純化方法主要采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離。Wang等[7]對(duì)新型稻曲菌素G的分離純化進(jìn)行了詳細(xì)探討，通過對(duì)甲醇、乙醇、丙酮和去離子水提取溶液的研究，發(fā)現(xiàn)去離子水提取效果最佳。在室溫下，去離子水和大米假黑穗球以1∶3(kg/L)的比例劇烈震蕩處理24 h，過濾后的濾液在60 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到含有稻曲菌素的殘?jiān)?。采用大孔吸附樹脂SP207層析，不同比例的乙醇-水為流動(dòng)相，得到不同組分。然后采用半制備液相配備ODS柱和Sephadex G-15層析柱，不同比例甲醇-水(含有0.02%三氟乙酸)作為流動(dòng)相，分離得到不同組分的純品。

2.2 稻曲菌素的檢測(cè)

目前針對(duì)稻曲菌素的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)的薄層層析法、酶聯(lián)免疫法(多克隆抗體)、高效液相色譜法以及近幾年來廣泛采用的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及單克隆抗體類酶聯(lián)免疫法。由于A和B兩種類型是稻曲菌素的主要組成部分，因此，目前方法主要針對(duì)這兩種毒素進(jìn)行檢測(cè)。前3種方法針對(duì)的是稻曲菌素A，并且已有文獻(xiàn)[5]綜述，在此主要介紹后兩種新建立的方法，能夠同時(shí)檢測(cè)主要的兩種稻曲菌素A和B。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。Shan等[12]首次通過液質(zhì)聯(lián)用法(LC-ESI-MS)和高效液相(HPLC-UV)同時(shí)測(cè)定分析感染了稻綠核菌大米中稻曲菌素A和B的含量。首先采用液相質(zhì)譜聯(lián)用確定組分，再采用高效液相檢測(cè)含量。簡(jiǎn)要流程如下：取一定量樣品，去離子水抽提3次，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到殘?jiān)?，取其中少部分?jīng)過離子交換處理后，液相-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS)檢測(cè)確定樣品組成。液相條件：Synergi reversed-phase Hydro-C18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(體積比為15∶85)含0.02%三氟乙酸，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。質(zhì)譜條件：ESI正離子工作模式，掃描范圍100～1 000m/z，壓力35 psi(241.325 kPa)，干燥氣體溫度350 ℃，干燥氣體流量8.0 L/min，毛細(xì)管電壓3 500 V，總分析時(shí)長(zhǎng)30 min。

酶聯(lián)免疫法。陳美軍等[13]、Fu等[14]采用單克隆抗體類酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(icELISA)方法對(duì)水稻和飼料樣品中的稻曲菌素A進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)要流程如下：首先將大米假黑穗球粉碎并在室溫下用去離子水萃取3次，水提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后經(jīng)過大孔吸附樹脂HP-20吸附, ODS-AQ、Sephadex LH-20和Sephadex G-15等柱層析，獲得稻曲菌素A和稻曲菌素B純品。使用戊二醛法將稻曲菌素A與BSA、OVA綴合以分別制備免疫原(UA-BSA)和包被抗原(UA-OVA)。然后免疫雌性Balb/c小鼠，產(chǎn)生并純化獲得單克隆抗體mAb 2D3G5，IC50為13.8 ng/mL，工作范圍為2.8～72 ng/mL。在前期工作基礎(chǔ)上，F(xiàn)u等[11]最近成功開發(fā)出直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(dc-ELISA)同時(shí)測(cè)定稻曲菌素A和B的總含量，簡(jiǎn)要流程如下：分別純化得到稻曲菌素A和B，將稻曲菌素B分別通過戊二醛法與雞卵白蛋白和牛血清蛋白結(jié)合制備抗原(UB-OVA/UB-BSA)，將稻曲菌素A與辣根過氧化物酶連接，經(jīng)過免疫小鼠等一系列流程獲得單克隆mAb 4C4F11，對(duì)稻米中稻曲菌素A和B的最低檢測(cè)限分別為35 ng/g和100 ng/g。

3 稻曲菌素的生物活性

3.1 對(duì)微管蛋白的作用

呂仕瓊等[5]對(duì)稻曲菌素A、B、C、D、F抑制微管蛋白的組裝和解聚機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)綜述，其中稻曲菌素A 對(duì)微管蛋白組裝的半抑制濃度最低。稻曲菌素A對(duì)于微管蛋白的抑制機(jī)理在于阻斷了β-微管蛋白中特定鏈內(nèi)交聯(lián)的形成，同時(shí)抑制了碘代乙酰胺對(duì)微管蛋白的烷基化作用，并且稻曲菌素 A能夠強(qiáng)烈促進(jìn)秋水仙堿與微管蛋白的結(jié)合[15]。Joullié等[16]采用化學(xué)合成手段獲得了稻曲菌素D的4種類似物D1、D2、D3、D4，并研究了對(duì)微管蛋白聚合的影響。研究結(jié)果顯示D1和D4對(duì)微管蛋白無抑制作用，其IC50大于40 μmol/L，這表明天然存在的稻曲菌素D大環(huán)大小是最合適的。D3表現(xiàn)出輕微的抑制作用，但其總的IC50也大于40 μmol/L。醚橋上立體碳去除后獲得的稻曲菌素D2抑制效果較好，其IC50值為 (9.2±2.0) μmol/L。對(duì)稻曲菌素D與D2、D3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接模擬結(jié)果顯示，甘氨酸側(cè)鏈發(fā)生了明顯的扭曲，使其逐漸靠近纈氨酸殘基。外部的甘氨酸側(cè)鏈可能會(huì)降低分子在這個(gè)位置的結(jié)合能力，但也可能會(huì)阻礙與纈氨酸殘基的結(jié)合能力，這對(duì)其發(fā)揮抑制作用極其關(guān)鍵。

3.2 對(duì)人體癌細(xì)胞的抑制作用

Koiso等[17]研究了稻曲菌素A和B對(duì)人的胃、肺、心臟、結(jié)腸和腎的癌細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示兩種毒素均能抑制供試的癌細(xì)胞。Wang等[7]采用紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照(CK)，研究了稻曲菌素A、B、D、F、G對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116)、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(NCI-H1650)、胃癌細(xì)胞(BGC-823)、肝癌細(xì)胞(HepG2)、肺腺癌細(xì)胞(A549)以及黑色素瘤細(xì)胞(A375)系的毒性。結(jié)果顯示稻曲菌素D、F和G對(duì)HCT116、NCI-H1650、BGC-823和HepG2表現(xiàn)出較弱的抑制活性，此外稻曲菌素G對(duì)細(xì)胞系A(chǔ)549和A375表現(xiàn)出弱活性，IC50值分別為36.5、22.5 μmol/L;稻曲菌素A對(duì)HCT116、NCI-H1650、HepG2抑制活性也較弱，對(duì)人腫瘤細(xì)胞系BGC-823和A549顯示出中等活性，IC50分別為2.66、3.12 μmol/L；稻曲菌素B對(duì)A549抑制活性較差，它們的半抑制濃度IC50均超過了50 μmol/L，對(duì) BGC-823細(xì)胞系抑制活性較好，而對(duì)HCT116、NCI-H1650和HepG2細(xì)胞系的抑制活性一般。

3.3 對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用

研究表明，大米假黑穗球的水浸出液對(duì)水稻、玉米以及小麥等的胚芽和胚根生長(zhǎng)均有抑制作用。Koiso等[17]研究了不同質(zhì)量濃度的稻曲菌素A對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示當(dāng)其質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，幾乎完全抑制胚根和胚芽的生長(zhǎng)。Wang等[7]以草甘膦為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)分離純化得到的稻曲菌素A、B、D、F、G對(duì) “Lijiang”和 “Zhonghua11”兩個(gè)水稻品種的種子胚根和胚芽伸長(zhǎng)抑制活性研究發(fā)現(xiàn)：稻曲菌素A、B以及G對(duì)兩類種子的胚根和胚芽的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)3種毒素還能夠引起水稻幼苗根系和胚芽的異常膨脹。結(jié)果顯示，稻曲菌素A、B和G的抑制作用強(qiáng)于D和F，說明C-12側(cè)鏈的亞硫酰基結(jié)構(gòu)對(duì)于稻曲菌素發(fā)揮抑制作用具有重要影響。

4 稻曲菌素合成途徑

4.1 化學(xué)合成途徑

由于稻曲菌素具有作為抗腫瘤藥物、殺蟲劑等應(yīng)用的潛力，其化學(xué)合成方法的研究也備受關(guān)注。在稻曲菌素家族中，D類型毒素是較簡(jiǎn)單的同系物之一，具有較高的生物活性，對(duì)其化學(xué)合成方法的研究可為其他化合物的合成提供骨架組成部分[18]。因此，目前稻曲菌素的化學(xué)合成主要集中在D類型的研究[19-21]，其合成途徑已經(jīng)由最初的20個(gè)化學(xué)反應(yīng)發(fā)展到通過6個(gè)步驟的ammonia-Ugi 反應(yīng)即可得到[22]。

4.2 生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理

截至目前，稻曲菌素的合成途徑及調(diào)控機(jī)制研究主要集中在黃曲霉中，特別是稻曲菌素B合成途徑的研究。在此，主要以黃曲霉為對(duì)象進(jìn)行介紹。依據(jù)催化酶的不同，可以將次級(jí)代謝產(chǎn)物分為聚酮合酶類(polyketide Synthases, PKSs)、非核糖體多肽酶類(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)以及萜環(huán)化物(terpene cyclases)等[23]，比如黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素、震顫毒素等屬于PKS類型的化合物[24]。根據(jù)稻曲菌素由多個(gè)非蛋白類的氨基酸組成的特點(diǎn)，最初認(rèn)為其屬于NRPS類型的化合物。采用基于基序從頭檢測(cè)算法(motif-independent de novo detection algorithm, MIDDAS-M)對(duì)黃曲霉中基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其合成途徑中的酶并不存在NRPS所具有的特異性催化結(jié)構(gòu)域，如PCP、TE等結(jié)構(gòu)域，而是屬于核糖體合成和翻譯后修飾肽類(Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs)化合物[8]。該類化合物在細(xì)菌中較為常見，如1998年發(fā)現(xiàn)的枯草菌素等[25-26]；在真菌中，只有白毒傘蘑菇中的兩個(gè)化合物α-amanitin和phallacidin的結(jié)構(gòu)被鑒定[27]。在子囊菌中，目前只有黃曲霉中的稻曲菌素合成途徑得到鑒定[8-10]。

稻曲菌素的生物合成途徑包含了一系列的酶促反應(yīng)過程，涉及多個(gè)基因，分布在基因組30 kb范圍內(nèi)。這些基因編碼了稻曲菌素前體蛋白、兩個(gè)氧化酶、依賴于腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶、兩個(gè)含黃素單加氧酶、半胱氨酸脫硫酶以及C6類型的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子等。以下對(duì)生物合成途徑涉及的主要酶及基因做詳細(xì)介紹。

稻曲菌素前體蛋白(ustA，基因號(hào)AFLA_094980)：盡管RiPS類型化合物合成途徑各異，但是都存在一個(gè)前體蛋白。在黃曲霉中ustA編碼該蛋白合成，該序列包含16個(gè)重復(fù)短肽“YAIG”，是合成稻曲菌素的基本單元。短肽的C端和N端分別包含相似的序列，該序列可能為ustP1、ustP2和ustH編碼肽酶的識(shí)別位點(diǎn)。目前已知的RiPS前體蛋白中只含有一個(gè)核心肽，而黃曲霉中多個(gè)重復(fù)肽段的存在可能有助于稻曲菌素產(chǎn)量的提高[8]。

酪氨酸酶(ustQ, AFLA_095060)與兩個(gè)氧化酶(ustYa, AFLA_094990和ustYb, AFLA_095020)：ustQ與ustYb基因單獨(dú)缺失之后，稻曲菌素B仍有少量產(chǎn)生；ustYa和ustYb同時(shí)缺失之后，稻曲菌素F合成被阻斷，表明這3個(gè)基因促進(jìn)了氧原子與酪氨酸芳香環(huán)以及異亮氨酸側(cè)鏈的交聯(lián)，共同參與了環(huán)肽中間體的形成。其中ustYa和ustYb編碼的酶均含有“HXXHC”基序，可能是該酶的活性中心[10]。

甲基轉(zhuǎn)移酶(ustM, AFLA_095100)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(ustC, AFLA_094960)、黃素單加氧酶(ustF1, AFLA_094950; ustF2, AFLA_095050)以及依賴于5′-磷酸吡哆醛(PLP)酶(ustD, AFLA_095040): 通過甲基轉(zhuǎn)移酶和單加氧酶催化的氧化還原反應(yīng)，將甲基和硫元素添加至側(cè)鏈，然后在黃素單加氧酶的催化下，通過兩輪N-羥基化反應(yīng)以及脫羧脫水反應(yīng)得到中間化合物，類似的反應(yīng)過程也存在于淺藍(lán)霉素A的合成過程中[28]。ustD主要催化天冬氨酸脫羧生成烯胺。

研究表明，稻曲菌素生物合成途徑受到Zn(II)2Cys6 (C6)類型的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子ustR、枯草桿菌蛋白酶類似的內(nèi)切蛋白酶kexB以及全局調(diào)控因子LaeA的調(diào)控。在黃曲霉中，通過將ustR的啟動(dòng)子更換為TEF1基因啟動(dòng)子后，其轉(zhuǎn)錄水平提高了15倍，稻曲菌素B的產(chǎn)量提高了4.8倍[8]。

在黃曲霉和稻綠核菌中，稻曲菌素前體蛋白u(yù)stA的N端均含有進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽，C端含有一個(gè)堿性氨基酸的重復(fù)序列“KR”，這與釀酒酵母中內(nèi)切蛋白酶kex2的作用位點(diǎn)類似[29]。在釀酒酵母中，kex2編碼了依賴于Ca2+的跨膜絲氨酸蛋白酶，能夠水解KR的羧基側(cè)鏈[30]。在米曲霉中，kex2同源基因kexB參與前體蛋白處理得到了驗(yàn)證，在一株缺失kexB基因且對(duì)ustR進(jìn)行過量表達(dá)的菌株(ustREX/ΔkexB)中，雖然ustR轉(zhuǎn)錄水平得到了增強(qiáng)，但是產(chǎn)物中檢測(cè)不到稻曲菌素B。為了進(jìn)一步驗(yàn)證kexB的作用，同時(shí)構(gòu)建了米曲霉10個(gè)蛋白酶缺陷株和ustR過量表達(dá)菌株(ustREX/ΔP10)，結(jié)果表明與單獨(dú)過量表達(dá)ustR的菌株相比(ustREX)，二者產(chǎn)生的稻曲菌素含量相同，表明kexB對(duì)于稻曲菌素的合成是必須具有特異性[31]。根據(jù)此研究結(jié)果，Umemura等[8]完善了kexB調(diào)控稻曲菌素的合成途徑，首先ustA蛋白在經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體的過程中，必須經(jīng)過kexB對(duì)其C端的“KR”進(jìn)行識(shí)別并切割，在此過程中還需要另外兩個(gè)絲氨酸肽酶ustP和ustH的協(xié)助;然后在ustQ等酶催化下經(jīng)過甲基化、環(huán)化等反應(yīng)，形成中間產(chǎn)物稻曲菌素F;最后在ustM、ustD等作用下經(jīng)過脫羧、脫水機(jī)縮合等反應(yīng)形成稻曲菌素B。

LaeA 作為全局性調(diào)控因子廣泛存在于黃曲霉、紅曲霉、稻瘟菌等絲狀真菌中，對(duì)黃曲霉毒素、青霉素等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物具有調(diào)控作用[32]。Lv等[33]最近通過對(duì)黃曲霉野生型菌株和LaeA缺陷型菌株蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，包括稻曲菌素合成前體ustA在內(nèi)的4種酶(ustH、ustM和ustD)的表達(dá)量均出現(xiàn)了大幅度的下調(diào)，含量分別為野生型的0.13、0.46、0.34和0.22，表明LaeA可能參與了稻曲菌素合成的調(diào)控。

5 展望

目前，稻曲菌素的研究主要集中在新結(jié)構(gòu)的分離鑒定、毒性分析、化學(xué)合成及新的檢測(cè)方法的建立，并且取得了較大的進(jìn)展。然而稻曲菌素生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究還處在初級(jí)階段，主要集中在生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的功能研究，仍然停留在基因組水平。研究表明，胞外多種環(huán)境因子如溫度、濕度、水分活度等,營(yíng)養(yǎng)元素如碳源、氮源、無機(jī)鹽等,相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后修飾水平(甲基化、乙?；⒘姿峄?、SUMO化、巴豆酰化等)的調(diào)控對(duì)次級(jí)代謝的產(chǎn)生均具有顯著的影響[34-36]，而稻曲菌素在這些方面的調(diào)控研究鮮有報(bào)道。筆者認(rèn)為在這些方面開展工作，不但有利于進(jìn)一步闡明稻曲菌素的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，對(duì)于制定新的、有效的策略對(duì)稻綠核菌進(jìn)行生物防控以期阻斷稻曲菌素的污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。