張勝忠，苗華榮，趙立波，崔鳳高，張智猛，孫令強(qiáng)，胡曉輝*，陳 靜*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.青島市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，山東 青島 266071)3.青島市農(nóng)業(yè)機(jī)械服務(wù)中心，山東 青島 266071)

花生(ArachishypogaeaL.)是我國主要油料和經(jīng)濟(jì)作物，常年種植面積約500萬hm2，總產(chǎn)1500萬t左右，花生高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對保障我國植物油脂和植物蛋白的安全供給具有重要意義。花生粒型，包括粒長、粒寬以及長寬比，直接決定粒重，進(jìn)而影響花生產(chǎn)量[1]。花生種子長寬比直接決定花生籽仁形狀，是影響花生外觀和加工品質(zhì)的重要因素[2]。因此，加強(qiáng)花生粒型(特別是種子長寬比)遺傳機(jī)理的研究，對于通過遺傳調(diào)控培育符合粒型目標(biāo)的花生新品種具有重要意義。

栽培種花生是異源四倍體，起源于兩個野生種雜交，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄[3-6]，有關(guān)花生粒型性狀遺傳分析和相關(guān)分子標(biāo)記研究相對滯后。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，花生種子長寬比遺傳機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。粒型性狀相關(guān)性分析表明，種子長寬比與種子長度呈正相關(guān)、與種子寬度相關(guān)性不顯著[7]。李振動等利用徐州68-4和遠(yuǎn)雜9102雜交構(gòu)建的195個RIL家系，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，定位到9個控制種子長寬比的QTL位點(diǎn)，其中1個QTL在兩個環(huán)境中均可檢測到，遺傳貢獻(xiàn)率為10.75%～23.70%[8]。Chen等利用‘富川大花生’和‘ICG6375’雜交構(gòu)建的RIL群體，基于SSR標(biāo)記定位到9個控制種子長寬比的QTL，遺傳貢獻(xiàn)率為5.5%～11.8%[9]。Wang等利用‘ZH6’和‘sd-H1’雜交構(gòu)建RIL群體，基于高密度遺傳圖譜檢測到3個種子長寬比相關(guān)QTL[7]。

總體而言，花生籽仁長寬比性狀遺傳機(jī)制的研究仍然很不完善，定位到QTL數(shù)目依然較少，分子標(biāo)記輔助育種工作難以有效開展。本課題組前期利用高產(chǎn)抗逆大花生品種‘花育36號’和高油小花生品系‘高油613’，完成了重組自交系群體(RIL)的構(gòu)建。本研究通過對該RIL群體種子長寬比進(jìn)行遺傳分析和相關(guān)SSR標(biāo)記挖掘，為后續(xù)相關(guān)QTL/基因的定位和克隆奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以‘花育36號’ב高油613’構(gòu)建的重組自交系群體RIL為試驗(yàn)材料。該群體包含181個家系。母本‘花育36號’為山東省花生研究所育成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆大花生品種，粒型較長，通過了山東省農(nóng)作物品種審定委員會審定、國家鑒定和非重要農(nóng)作物品種登記，獲得了植物新品種保護(hù)權(quán)；父本‘高油613’為山東省花生研究所育成的高油品系，粒型短圓。2017-2018年將RIL群體和親本分別種植于海南省三亞市南濱農(nóng)場和山東省萊西市花生研究所試驗(yàn)站，成熟收獲后晾干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間種植

將RIL群體(F2:6-7)和親本于2個環(huán)境下種植。環(huán)境1(E1)：2017年11月種植于海南省三亞市南濱農(nóng)場，2018年3月份收獲；環(huán)境2(E2)：2018年5月種植在山東省萊西市花生研究所試驗(yàn)站，同年9月份收獲。種植方式為起壟雙行單粒播種，行距40 cm，株距16.7 cm，每個家系種植10株，進(jìn)行覆膜。種植成熟收獲后，晾曬至種子含水量低于10%。田間水肥管理等同于常規(guī)大田，及時進(jìn)行病蟲害防治。

1.2.2 植物基因組DNA提取

幼苗期采集花生親本和RIL家系嫩葉，貯存于-70℃冰箱中。分別將各樣品于液氮中研磨，利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根)提取DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA質(zhì)量、ND-1000分光光度計(jì)檢測DNA濃度。

1.2.3 SSR分析

SSR引物選自前人已發(fā)表的引物序列[10-14]，由南京金斯瑞有限公司合成。共篩選到11對多態(tài)性SSR引物，引物序列見表5。將多態(tài)性引物序列，與栽培種花生參考基因組(https://www.peanutbase.org/)進(jìn)行BLASTn比對，確定引物的物理位置。利用多態(tài)性SSR引物對親本和RIL家系進(jìn)行SSR標(biāo)記基因型分析，母本基因型記作‘0’，父本基因型，記作‘2’。PCR反應(yīng)體系(10μL)：DNA模板1μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，ddH2O 3μL，SSR引物1μL。SSR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90 s，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性PAGE凝膠上分離，硝酸銀染色后在醫(yī)用燈箱上進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 花生種子長寬比測定

每個家系和親本隨機(jī)挑選20粒成熟種子，利用萬深SC-G種子自動考種分析(萬深SC-A1型)，測定種子長度、種子寬度，利用Excel軟件計(jì)算長寬比，取平均值。種子長寬比(Ratio of seed length to seed width, SL/SW)=種子長度/種子寬度

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對RIL種子長寬比進(jìn)行次數(shù)分布統(tǒng)計(jì)，計(jì)算相關(guān)遺傳參數(shù)，包括群體平均數(shù)、方差、最大值、最小值、變異系數(shù)、偏度、峰度等。根據(jù)數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型的聯(lián)合分離分析方法[15-18]，對花生種子含油量進(jìn)行遺傳分析，根據(jù)最大熵信息準(zhǔn)則(Akaike' s information criterion, AIC)最小、適合性檢驗(yàn)，包括均勻性檢驗(yàn)(U12、U22、U32)、Smimov檢驗(yàn)(nW2)和Kolmogorov檢驗(yàn)(Dn)、親本與雜種后代的表現(xiàn)選擇最優(yōu)遺傳模型。獲得最優(yōu)遺傳模型后，按最小二乘法計(jì)算出成分分布參數(shù)，由成份分布參數(shù)估計(jì)遺傳參數(shù)。利用χ2測驗(yàn)對SSR進(jìn)行分離比適合性檢驗(yàn)。利用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對標(biāo)記基因型和種子長寬比表型進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和RIL群體種子長寬比表型分析

由圖1所示，親本種子形態(tài)存在顯著差異，母本‘花育36號’的種子長寬比為1.85±0.08，父本‘高油613’的種子長寬比為1.37±0.06(圖1A，B)。調(diào)查RIL群體在2個環(huán)境下種子長寬比性狀，結(jié)果表明RIL群體存在廣泛的變異和超親現(xiàn)象(表1，圖2)。在環(huán)境E1(2017，三亞)下，RIL群體種子長寬比變異幅度為1.20～2.19，群體平均值為1.69，偏向高值親本，變異系數(shù)為0.13。在環(huán)境E2(2018，萊西)下，RIL群體種子長寬比變異幅度為1.25～2.38，群體平均值為1.82，偏向高值親本，變異系數(shù)為0.14。RIL群體種子長寬比次數(shù)分布圖表現(xiàn)為連續(xù)分布，符合數(shù)量性狀分布規(guī)律，適合進(jìn)一步開展相關(guān)遺傳分析。

圖1 親本種子長寬比分析

表1 RIL群體種子長寬比性狀變異

注：E1：2017，三亞；E2：2018，萊西。下同。

Note: E1: 2017, Sanya; E2: 2018, Laixi.Same as below.

圖2 2個環(huán)境下RIL家系種子長寬比次數(shù)分布

表2 聯(lián)合分析的遺傳模型和相應(yīng)的AIC值

表3 遺傳模型的適合性檢驗(yàn)

注：U12、U22、U32：均勻性檢驗(yàn)；nW2：Smimov檢驗(yàn)；Dn：Kolmogorov檢驗(yàn)。

Note:U12,U22,U32, Equality test；nW2, Smimov test;Dn, Kolmogorov test.

2.2 遺傳模型分析和相關(guān)遺傳參數(shù)估計(jì)

利用主基因+多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析方法[15-18]，對2個環(huán)境下P1、P2、RIL群體的種子長寬比進(jìn)行遺傳分析。通過程序計(jì)算得到1對主基因(A)、2對主基因(B)、多基因(C)、1對主基因+多基因(D)、2對主基因+多基因(E)、3對主基因(F)、3對主基因+多基因(G)、4對主基因+多基因(H)、4對主基因+多基因(I)共9類65個遺傳模型的極大對數(shù)似然函數(shù)值和AIC值。根據(jù)AIC值最小原則選擇較適宜的4個備選遺傳模型。在E1環(huán)境下，模型A_1、C_1、C_0、B_1_8為備選遺傳模型；在E2環(huán)境下，模型A_1、C_1、C_0、B_1_8為備選遺傳模型(表2)。

由表3所示，對2個環(huán)境下種子長寬比性狀的備選模型進(jìn)行適合性檢測。在環(huán)境E1(2017，三亞)，備選模型A_1有14個統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，模型C_1、C_0均有12個統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，模型B_1_8有8個統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，因此B_1_8為最適模型，即2對存在重疊作用的獨(dú)立主基因遺傳模型；在環(huán)境E2(2018，萊西)，備選模型A_1、C_1、C_0均有12個統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，模型B_1_7有10個統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平，因此B_1_7為最適模型，即2對存在互補(bǔ)作用的獨(dú)立主基因遺傳模型。

選定最適遺傳模型后，按最小二乘法算出成分分布參數(shù)，由成分分布參數(shù)估計(jì)主基因的遺傳率(表4)。結(jié)果所示，在環(huán)境E1下，種子長寬比滿足2對主基因互作效應(yīng)為-0.19，主基因遺傳率89.86%；在環(huán)境E2下，種子長寬比滿足2對主基因互作效應(yīng)為-0.22，主基因遺傳率為92.04%。

2.3 種子長寬比性狀相關(guān)SSR標(biāo)記篩選

利用前人已報(bào)道的SSR標(biāo)記對親本‘花育36號’和‘高油613’進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到11對多態(tài)性SSR標(biāo)記，且能對181個RIL家系成功分型(表5)。將RIL家系中各SSR標(biāo)記基因型(0，2)與種子長寬比進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)只有1個SSR(即AGGS1325)在2個環(huán)境下均與種子長寬比呈顯著性負(fù)相關(guān)，即基因型為‘0’型，種子長寬比較大；‘2’型，種子長寬比較小，相關(guān)系數(shù)分別為-0.396(E1)和-0.244(E2)(圖3，表7)?？ǚ綔y驗(yàn)表明該標(biāo)記在RIL群體中分離比符合1:1，不存在偏分離現(xiàn)象(表6)。對RIL群體中，不同AGGS1325基因型個體，種子長寬比存在顯著性差異，‘花育36號’基因型促進(jìn)種子長寬比增加(圖4)。以上結(jié)果表明，標(biāo)記AGGS1325區(qū)段可能存在控制種子長寬比基因。

表4 種子長寬比遺傳參數(shù)估計(jì)

表5 用于種子長寬比相關(guān)分析的多態(tài)性SSR標(biāo)記

3 討 論

本試驗(yàn)所使用的‘花育36號’種子較長，‘高油613’種子表現(xiàn)為短圓，在種子長寬比性狀上存在顯著差異；RIL家系性狀表現(xiàn)為連續(xù)分布，且存在廣泛的超親現(xiàn)象，為相關(guān)性狀的遺傳分析和后續(xù)QTL/基因的定位奠定了材料基礎(chǔ)。數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法，在不同植物、不同性狀、不同世代的遺傳分析中得到廣泛應(yīng)用[19-22]。目前很少有對種子長寬比性狀進(jìn)行遺傳分析報(bào)道，本研究通過主基因+多基因混合遺傳模型分析，發(fā)現(xiàn)在2個環(huán)境下種子長寬比性狀均滿足2對主基因遺傳，且主基因具有較高遺傳率，但主基因間相互作用不同(表3，表4)。表明種子長寬比性狀選擇，適宜在世代早期進(jìn)行。前人報(bào)道多數(shù)產(chǎn)量性狀受多基因控制[23-25]，與本研究結(jié)果不同，原因可能是所用試驗(yàn)材料基因型與前人不同，導(dǎo)致性狀調(diào)控機(jī)制不同；或是本試驗(yàn)中多基因的遺傳效應(yīng)太小，無法有效檢測所致。因此在育種過程中，應(yīng)根據(jù)特定的試驗(yàn)材料，采用相應(yīng)的育種方法進(jìn)行遺傳改良，從而達(dá)到育種目標(biāo)。

圖3 SSR標(biāo)記AGGS1325分析親本和RIL家系基因型

表6 AGGS1325標(biāo)記分離比的χ2測驗(yàn)

表7 AGGS1325基因型和種子長寬比相關(guān)性分析

注：** 表示在 0.01 水平上顯著相關(guān)。

Note: ** represents significant level atp<0.01.

圖4 AGGS1325不同基因型對應(yīng)種子長寬比差異箱型圖

本研究檢測到位于A03染色體上的SSR標(biāo)記AGGS1325與種子長寬比存在顯著性相關(guān)(表7)，且該標(biāo)記不同基因型的RIL家系與種子長寬比存在顯著差異(圖4)，表明該標(biāo)記附近存在控制花生種子長寬比的QTL/基因，且‘高油613’在該位點(diǎn)的基因型對表型起增效作用。Chen等[9]利用‘富川大花生’和‘ICG6375’雜交構(gòu)建的RIL群體，檢測到9個控制種子長寬比的QTL，遺傳貢獻(xiàn)率為5.5%～11.8%，其中1個位于A03染色體。由于缺少共有SSR標(biāo)記，目前無法確定此位點(diǎn)是否與本研究中相關(guān)位點(diǎn)一致，仍需要對相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行定位分析。本研究通過對一個RIL種子長寬比性狀遺傳分析和相關(guān)SSR標(biāo)記挖掘，不僅為后續(xù)花生相關(guān)性狀的QTL/基因定位奠定了理論基礎(chǔ)，同時為培育理想粒型花生品種提供了潛在分子標(biāo)記。