張金鳳，成 波，曹延麗，遲玉成，鄢洪海*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生是世界上最重要的油料作物，在我國栽培歷史悠久，種植面積居世界第二位，產(chǎn)量居世界第一位，是我國為數(shù)不多的具有出口優(yōu)勢的農(nóng)作物之一[1]?；ㄉ捉伈∈腔ㄉ囊环N重要土傳真菌病害，世界各地均有發(fā)生，在美國和印度危害尤為嚴(yán)重[2]。近年來，由于耕作制度的改變，花生種植密度的增加，使得田間小氣候顯著改變，導(dǎo)致花生白絹病在我國一些主要種植區(qū)發(fā)生逐年加重，成為北方生產(chǎn)田的重要病害[3]?；ㄉ捉伈∈怯升R整小核菌(Sclerotiumrolfsii)侵染引起的土傳真菌病害，該病原菌具有寄主范圍廣，能侵染500多種植物，其中包括小麥、大豆、花生等一些重要農(nóng)作物[4]。

生產(chǎn)上防控花生白絹病以化學(xué)防治為主，因此存在著許多問題，如農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境、對人畜健康傷害大等。相比之下，生物防治有著安全、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。在眾多的生防菌中，木霉(Trichodermaspp.)以其高效性和廣譜性應(yīng)用最為廣泛，對病原真菌如鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉(Pythiumspp.)、疫霉(Phytophthoraspp.)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)均有抑制作用[5]。木霉菌可防控多種病原真菌，對土傳病害的防控尤為顯著，利用木霉菌可防治黃瓜枯萎病[5]、馬鈴薯黃萎病[6]、煙草黑脛病[7]及苦瓜枯萎病等[8-11]。

芽孢桿菌不僅能夠抑制植物病原真菌的生長繁殖，而且可以誘發(fā)植物抗病力增強(qiáng)[12]，如用芽孢桿菌防治花生白絹病[13]、煙草黑脛病[14]、煙草白粉病[15]等，Yongli對芽孢桿菌的研究也證明其具有誘導(dǎo)抗病性作用[16-17]。

本試驗(yàn)研究了木霉菌和芽孢桿菌對花生白絹病的防治效果及對花生植株抗性生理的影響，意在為今后木霉菌和芽孢桿菌制劑的研發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。供試菌株：木霉菌篩選采用土壤分離法獲得。取花生田植株根際的土壤1g，用無菌水稀釋制備10-1、10-2和10-3的土壤懸浮液。將10-2、10-3稀釋液1mL倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待PDA冷卻倒入培養(yǎng)皿，使土壤懸浮液與PDA充分混勻。于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～3d。獲得的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)、鏡檢，觀察菌絲和孢子梗以及菌落形態(tài)特征并初步鑒定其分類地位。芽孢桿菌篩選采用土壤分離法獲得。首先制備10-2和10-3的土壤懸浮液，然后采用平板劃線法，獲得單菌落后再進(jìn)行純化培養(yǎng)?；ㄉ捉伈【簭纳綎|省花生研究所萊西試驗(yàn)田發(fā)病的花生植株上采集病菌，分離獲得。供試花生品種為魯花11號，由山東省花生研究所提供。

1.2 防治花生白絹病的生防菌株篩選

用打孔器在已經(jīng)純化好的木霉菌、芽孢桿菌和白絹病菌培養(yǎng)基上分別制取直徑為1cm的菌餅，將白絹病菌菌餅置于PDA培養(yǎng)皿中距離中心點(diǎn)2cm的一側(cè)，而距離2cm的另一側(cè)分別放置木霉菌或芽孢桿菌菌餅，以無菌空白PDA餅塊作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。對峙培養(yǎng)在26℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，2～3d后觀察木霉菌、芽孢桿菌對白絹病菌拮抗和抑制效果，7d后測定抑菌效果。

抑菌率/%=(對照菌落直徑-處理菌落直經(jīng))/對照菌落直經(jīng)×100

(用十字交叉法測量病菌菌落直徑)

1.3 生防菌對花生白絹病控制作用

1.3.1 盆栽防控效果試驗(yàn)

將滅菌后的土壤裝在塑料盆中，把提前催芽的花生種子播于盆中，每盆10粒，共4個(gè)處理1個(gè)對照，重復(fù)3次?；ㄉ雒绾竺颗柚槐Ａ?株，之后正常管理，于開花期接種花生白絹病菌，即直接把病原真菌接種到土壤中，并于2d后將篩選出來的木霉菌株和芽孢桿菌同樣接種到土壤中，進(jìn)行防治花生白絹病效果測定。

1.3.2 菌株防控白絹病效果檢測

采取病情指數(shù)法進(jìn)行防治效果測定，花生白絹病分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

病情指數(shù)=∑(各級病根數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總根數(shù)×最高級代表值)×100

防治效果/%=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

1.3.3 花生防御酶活性測定

在花生接菌前和花生發(fā)病時(shí)分別對花生葉片進(jìn)行取樣，用于寄主防御酶活性測定。葉片SOD、CAT防御酶活性的測定參照劉家堯等[18]方法。

1.4 生防菌木霉菌與芽孢桿菌分子鑒定

1.4.1 芽孢桿菌RNA提取

菌種在液體培養(yǎng)基中過夜，取1.5mL菌液于EP管中，8000r/min離心1min獲得菌體，參考Frederick等[19]從細(xì)菌中制備基因組RNA法提取芽孢桿菌RNA。擴(kuò)增引物為27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，雙蒸水補(bǔ)足至50μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 4min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸 73℃10min。

表1 花生白絹病病情分級標(biāo)準(zhǔn)

取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，雙蒸水補(bǔ)足至50μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 4min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸 73℃10min。

取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4.2 木霉菌DNA提取

將獲得的木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3d。取適量菌絲于研缽中，加液氮研磨成粉末，移入EP管中。參照Frederick[21]利用CTAB法制備植物DNA法提取木霉菌DNA。擴(kuò)增引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。20μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL 2xMix、1μL Primer 2 、2μL DNA凝膠、雙蒸水補(bǔ)足到20μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 2min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min、35個(gè)循環(huán)、最后延伸 72℃ 10min[21]。取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2016對結(jié)果進(jìn)行圖表制作和對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用NCBI進(jìn)行序列DNA鑒定，利用MEGA.7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的供試生防菌菌株室內(nèi)抑菌測定

從土壤中獲得的真菌經(jīng)鏡檢(圖1)確定8個(gè)為木霉菌株，從土壤中獲得的1株細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色及性狀觀察確定為芽孢桿菌。經(jīng)平板對峙抑菌試驗(yàn)篩選有3個(gè)木霉菌株抑菌效果較好(圖2)，對花生白絹病菌的抑制率分別為：T1菌株58.52%、T2菌株47.73%、T3菌株39.02% ；1株芽孢桿菌對白絹病菌的抑制率60.8%(表2)，其抑菌效果最好(圖4)。

圖1木霉菌形態(tài)

Fig.1Trichodermamicroscopy

圖2木霉對花生白絹病菌的抑制效果

Fig.2AntagonisticeffectsofTrichodermaonCorticiumrolfsiiSaccardo

圖3花生白絹病菌(CK)

Fig.3CorticiumrolfsiiSaccardo(CK)

圖4芽孢桿菌對花生白絹病菌抑制效果

Fig.4AntagonisticeffectofBacillusonCorticiumrolfsiiSaccardo

表2 木霉及芽孢桿菌對白絹病菌的抑制率

表3 生防菌株的相似性分析與分子鑒定

2.2 木霉菌及芽孢桿菌菌株鑒定

對篩選出3株防治效果較好的木霉菌菌株和1株細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和性狀觀測，發(fā)現(xiàn)屬的特征較顯著，但種的特點(diǎn)不明確，為此，對它們進(jìn)行基因測序和分子鑒定(表3)。將測序獲得的木霉菌株序列在NCBI上以ITS序列進(jìn)行BLAST，進(jìn)行同源性分析。結(jié)果T1與棘孢木霉的基因相似度99.83%，T2與擬康寧木霉的基因相似度100%，T3與鉤狀木霉的基因相似度99.83%。測序獲得的芽孢桿菌序列在NCBI上以16s rDNA序列采用BLAST進(jìn)行同源性分析，T4與蠟狀芽孢桿菌的基因相似度為99.66%。

通過對木霉菌株ITS序列的測定，與NCBI上相似序列進(jìn)行比對，選擇同源性較高的3個(gè)菌株。利用MEGA.7軟件，將木霉的ITS序列作為外接菌，使用最大似然法構(gòu)建病原真菌系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5。采用Bootstrap1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹各分支的置信度。結(jié)果表明，木霉菌株T1聚類到Trichodermaasperllum進(jìn)化分枝上，木霉菌株T2聚類到T.asperellum進(jìn)化分枝上，木霉菌株T3聚類到T.hamatum進(jìn)化分枝上。T2與擬康寧木霉有較大的親緣關(guān)系；T1與棘孢木霉有進(jìn)化關(guān)系；T3與鉤狀木霉有較大的親緣關(guān)系。分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定一致，T1菌株為棘孢木霉T.asperellum，T2菌株為擬康寧木霉T.koningiopsis，T3菌株為鉤狀木霉T.hamatum。通過對芽孢桿菌16s rDNA序列的測定，與NCBI上相似序列進(jìn)行比對，選擇同源性較高的3個(gè)菌株。利用MEGA.7軟件，將歐文氏菌的16s rDNA序列作為外接菌，使用最大似然法構(gòu)建病原細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6。采用Bootstrap 1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹各分支的置信度。結(jié)果表明，芽孢桿菌菌株T4聚類到Bacilluscereus進(jìn)化分枝上，因此T4菌株為蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus。

圖5 木霉菌株進(jìn)化樹

圖6 芽孢桿菌進(jìn)化樹

2.3 生防菌株防控花生白絹病效果測定

土壤接種不同拮抗木霉和芽孢桿菌后，各個(gè)菌株對花生白絹病均有一定的防治效果(表4)。棘孢木霉的防治效果最好，防治效果可達(dá)68.05%，但是發(fā)病率為42.86%。擬康寧木霉的發(fā)病率最低為38.10%，防治效果為65.77%。鉤狀木霉的發(fā)病率為40%，防治效果為56.87%，防治效果較差。芽孢桿菌的發(fā)病率在4組處理中最高為61.7%，防治效果僅為13.28%。

2.4 供試生防菌株處理對花生植株抗性的影響

2.4.1 花生葉片中超氧化物歧化酶(SOD)變化

圖7表明，接種不同菌種花生葉片中超氧化物歧化酶在發(fā)病前與發(fā)病后變化差異較大?；ㄉ捉伈“l(fā)病后超氧化物歧化酶的活性顯著高于發(fā)病前，其中以接種棘孢木霉的花生葉片超氧化物歧化酶最高，芽孢桿菌次之。

圖7接種花生白絹病菌對花生植株SOD活性的影響

Fig.7EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonSODactivityofpeanutplants

注：T1為棘孢木霉，T2為擬康寧木霉，T3為鉤狀木霉，T4為蠟狀芽孢桿菌。下同。

圖8接種花生白絹病菌對花生植株中CAT活性的影響

Fig.8EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonCATactivityinpeanutplant

Note:T1isT.asperellum,T2isT.koningiopsis,T3isT.hamatum,T4isBacilluscereus.Thesameasbelow.

2.4.2 花生葉片中過氧化氫酶(CAT)的變化

圖8表明，接種不同菌種花生葉片中過氧化氫酶在發(fā)病前與發(fā)病后變化差異大?；ㄉ捉伈“l(fā)病后過氧化氫酶的活性顯著高于發(fā)病前，其中以接種芽孢桿菌的花生葉片過氧化氫酶最高，鉤狀木霉次之 (圖8)。

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗(yàn)從種植花生的土壤中分離到多株木霉菌和芽孢桿菌，但通過對峙培養(yǎng)篩選僅獲得3株木霉菌和1株芽孢桿菌對花生白絹病菌抑制效果較好。經(jīng)菌株形態(tài)觀察和DNA基因序列擴(kuò)增比對，3個(gè)木霉菌株分別為棘孢木霉、擬康寧木霉和鉤狀木霉，芽孢桿菌為蠟狀芽孢桿菌。

3.2 經(jīng)培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)試驗(yàn)，對花生白絹病菌抑制效果依次為芽孢桿菌>棘孢木霉>擬康寧木霉>鉤狀木霉；盆栽接菌處理防病試驗(yàn)效果依次是擬康寧木霉>鉤狀木霉>棘孢木霉>芽孢桿菌，生防菌對白絹病菌的拮抗作用與盆栽試驗(yàn)具有一定相關(guān)性，但并不完全呈正相關(guān)。張春秋等人研究的木霉與黃瓜枯萎病的平板對峙試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)[5]結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。這可能是由于生防菌的生長速度快，在平板試驗(yàn)中由于環(huán)境適宜、養(yǎng)分充足等原因在競爭中占明顯的優(yōu)勢，但是在盆栽試驗(yàn)中，可能由于土壤濕度、溫度、物理化學(xué)等諸多因素，對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。

3.3 當(dāng)植物用生防菌或誘抗劑處理時(shí)，植物體內(nèi)的SOD酶、CAT酶等防御酶活性往往會升高[5，8]。本試驗(yàn)在接種白絹病菌的花生土壤中施入生防木霉和芽孢桿菌后測定SOD等主要的防御酶系，發(fā)現(xiàn)花生植株體內(nèi)SOD酶、CAT酶也發(fā)生了不同程度升高，說明木霉菌和芽孢桿菌誘導(dǎo)了花生植株對白絹病菌的抗病性，這可能與防病控病作用有關(guān)。