葛向陽，何惠昭，徐 巖，張獻(xiàn)敏，何晨旭

（1.江南大學(xué)，江蘇無錫 214122；2.汝陽杜康釀酒有限公司，河南洛陽 471241）

中國白酒釀造的特點(diǎn)是固態(tài)多菌種自然發(fā)酵過程，近年來，隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)被應(yīng)用到傳統(tǒng)釀造工藝中。復(fù)合香堆積工藝就是在前人對傳統(tǒng)白酒釀造過程中功能微生物群系結(jié)構(gòu)與功能有了一定研究成果的基礎(chǔ)上，對傳統(tǒng)工藝的提升與創(chuàng)新。但是，由于技術(shù)方法的限制，對白酒釀造過程中微生物群落變化及其與酒醅理化的相關(guān)性分析還不夠全面及深入，從而不能明確各工藝控制要點(diǎn)對工藝乃至產(chǎn)品風(fēng)格的影響機(jī)制，這勢必減弱對傳統(tǒng)工藝的可控化程度。

為了明確杜康綿柔復(fù)合香原酒釀造過程中功能微生物的變化，及其影響酒醅理化指標(biāo)變化的機(jī)制，本研究利用可培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合堆積酒醅及窖池發(fā)酵過程中酒醅的理化分析結(jié)果，從整體上探索復(fù)合香原酒的釀造規(guī)律，真實(shí)反映出杜康綿柔復(fù)合香白酒釀造中對白酒產(chǎn)量和質(zhì)量有益的功能性微生物的影響機(jī)制。這對提高杜康綿柔復(fù)合香調(diào)味酒出酒率及酒質(zhì)，從而指導(dǎo)生產(chǎn)工藝的改進(jìn)具有重要價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 微生物分析樣品

1.1.1 考察對象

對堆積過程酒醅微生物群系進(jìn)行跟蹤分析。

1.1.2 堆積過程取樣要求

1.1.2.1 堆積過程取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)

在堆積的每8 h取1次樣，即第0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、堆積結(jié)束。

1.1.2.2 堆積過程取樣空間點(diǎn)設(shè)計(jì)

每次采樣分為表層、深表層2點(diǎn)。表層點(diǎn)（0～5 cm）、深表層點(diǎn)（10～40 cm），在每層區(qū)域內(nèi)取3個(gè)點(diǎn)混合均勻作為一個(gè)樣。取相鄰2個(gè)濃香型窖池入池酒醅作為對照。每次采樣分為表層、深表層、中間層3點(diǎn)。表層點(diǎn)（0～5 cm）、深表層點(diǎn)（10～40 m）、中間層點(diǎn)（堆子的核心部分），在每層區(qū)域內(nèi)取3個(gè)點(diǎn)混合均勻作為一個(gè)樣。

1.1.2.3 取樣方法

每一點(diǎn)同時(shí)從2個(gè)堆積層相同位置取樣，每個(gè)酒醅樣品500 g，分成兩份，貼好標(biāo)簽。其中300 g留在酒廠分析化驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)，200 g封好放入冰箱冷凍，后用取樣箱送往學(xué)校測定微生物等其他相關(guān)指標(biāo)。分析方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[1-3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆積過程中微生物菌群的變化

2.1.1 堆積過程中細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢

3組樣品稀釋涂布培養(yǎng)后，細(xì)菌在平板上的菌落形態(tài)如圖1所示。由于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基也繁殖生長酵母菌，所以平板上菌落形態(tài)較小的才是細(xì)菌。

從平板上挑取細(xì)菌，稀釋后在顯微鏡下觀察的細(xì)菌形態(tài)如圖2所示。大的菌體為酵母，小的菌體為細(xì)菌。

3組樣品稀釋涂布，培養(yǎng)48 h后，得到的堆積過程中細(xì)菌總數(shù)的變化如圖3所示。

圖1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上堆積酒醅細(xì)菌菌落形態(tài)

圖2 顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)

圖3 3組樣品堆積過程中細(xì)菌數(shù)量的變化

從圖3可以看出，在堆積過程中，上層、中層和下層堆積樣品中的細(xì)菌總數(shù)都在增加，前8 h細(xì)菌增長緩慢，之后，細(xì)菌增長迅速，到堆積結(jié)束，細(xì)菌總數(shù)增長到5×107～6×107個(gè)/g物料，堆積物料上層細(xì)菌總數(shù)在增長速率和總數(shù)上高于下層物料細(xì)菌總數(shù)，主要是上層物料與空氣的接觸面較大有關(guān)。

2.1.2 堆積過程中酵母菌總數(shù)的變化趨勢

3組樣品稀釋涂布培養(yǎng)后，酵母在平板上的菌落形態(tài)如圖4所示。由于孟加拉紅培養(yǎng)基也長霉菌，所以平板上菌落沒有長毛形態(tài)較小的才是酵母菌。

圖4 孟加拉紅培養(yǎng)基上酒醅酵母菌落形態(tài)

從平板上挑取酵母菌，稀釋后在顯微鏡下觀察的酵母菌形態(tài)如圖5所示。

圖5 顯微鏡下酵母菌形態(tài)

3組樣品稀釋涂布，培養(yǎng)48 h后，得到的堆積過程中酵母菌總數(shù)的變化如圖6所示。

圖6 3組樣品堆積過程中酵母菌數(shù)量的變化

從圖6可看出，酵母菌總數(shù)與細(xì)菌總數(shù)在堆積過程中數(shù)量變化的趨勢一致，都呈現(xiàn)持續(xù)增長，上層酵母菌在增長速率和數(shù)量上也都多于下層酵母菌。堆積結(jié)束后，酵母菌總數(shù)為4×107～5×107個(gè)/g物料，在總數(shù)上比細(xì)菌少。從細(xì)菌和酵母的總數(shù)可以看出，堆積過程是一個(gè)有益微生物大量增殖的過程，這對后期發(fā)酵的進(jìn)行有重大的影響。

2.1.3 堆積過程中霉菌總數(shù)的變化趨勢

3組樣品稀釋涂布培養(yǎng)后，霉菌在平板上的菌落形態(tài)如圖7所示，由于孟加拉紅培養(yǎng)基也繁殖生長酵母菌，所以平板上菌落長毛形態(tài)較大的是霉菌。圖7A是培養(yǎng)48 h的霉菌，圖7B是培養(yǎng)3 d之后的霉菌，此時(shí)河內(nèi)白曲霉菌已經(jīng)開始產(chǎn)孢子，顏色由白色變成了暗黃色。

圖7 孟加拉紅培養(yǎng)基上霉菌菌落形態(tài)

從平板上挑取霉菌，稀釋后在顯微鏡下觀察的霉菌形態(tài)如圖8所示。圖8A是霉菌的形態(tài)，圖8B是河內(nèi)白曲霉菌產(chǎn)孢子時(shí)的形態(tài)。

圖8 顯微鏡下河內(nèi)白曲霉菌形態(tài)

3組樣品稀釋涂布，培養(yǎng)48 h后，得到的堆積過程中霉菌總數(shù)的變化如圖9所示。

從圖9可知，河內(nèi)白曲霉菌在0～16 h內(nèi)迅速降低。由總體數(shù)據(jù)可以看出，河內(nèi)白曲霉菌在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于細(xì)菌和酵母，而且由于堆積環(huán)境不利于霉菌的生長繁殖，所以堆積的工藝并不適宜霉菌的富集。

圖9 3組樣品堆積過程中河內(nèi)白曲霉菌數(shù)量的變化

16 h前堆積物料的溫度在20～30 ℃，且是微氧條件，適合酵母、細(xì)菌的生長繁殖，而16 h后由于溫度的升高、氧氣的減少，微生物增長幅度相對減緩。細(xì)菌和酵母相同，上層高于下層，主要是由于物料上層與環(huán)境接觸，溫度與水分受環(huán)境影響較大所致，堆積到后期可以看見堆積物料上有白色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

2.2 堆積過程中糟醅理化指標(biāo)的變化趨勢

圖10 堆積過程中上層糟醅理化指標(biāo)的變化

鑒于酒醅理化指標(biāo)變化的梯度，本研究選取了上層酒醅及下層酒醅分別進(jìn)行理化指標(biāo)分析，分析項(xiàng)目為：酒醅酒精含量、淀粉、酸度、糖分、水分，變化趨勢如圖10和圖11所示。從圖10和圖11可見，上層和下層堆積酒醅的過程中水分都是逐步增大的過程，堆積結(jié)束時(shí)，水分維持在57 %～58 %之間。總體上分析：無論是上層酒醅還是下層酒醅，堆積結(jié)束后消耗淀粉約5 %，酒醅酒精含量為2.5 %vol左右，酒醅糖分為3%左右；而酸度變化不明顯。

2.3 發(fā)酵過程中糟醅理化指標(biāo)的變化趨勢

圖11 堆積過程下層糟醅理化指標(biāo)的變化

為了探索堆積酒醅在窖池中的變化規(guī)律，本研究對入池后上層和下層酒醅的理化變化進(jìn)行了跟蹤分析，總體變化趨勢如圖12和圖13所示。

圖12 發(fā)酵過程上層糟醅理化指標(biāo)的變化

圖13 發(fā)酵過程下層糟醅理化指標(biāo)的變化

從圖12和圖13可以看出，發(fā)酵過程中，總體水分呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律，酸度逐漸增高；上層酒醅酒精最高濃度為發(fā)酵后的10～15 d，而下層酒醅酒精最高濃度出現(xiàn)在35 d左右，酒醅最高酒精濃度為8 %vol～9 %vol之間?？傮w顯示上層酒醅理化指標(biāo)變化較為劇烈。

3 結(jié)論

復(fù)合香堆積發(fā)酵過程實(shí)際上就是各類微生物的代謝消長的過程，微生物的生長繁殖起著決定性的作用，其中淀粉的消耗、水分和酸度的變化與微生物數(shù)量之間呈現(xiàn)相互影響、相互制約的關(guān)系。在堆積過程中，細(xì)菌與酵母的數(shù)量持續(xù)增長，而霉菌則逐步凋亡。由于受外界環(huán)境的影響，在發(fā)酵過程中，上層糟醅比起下層糟醅在各個(gè)方面的指標(biāo)變化都顯著，這也是酒醅風(fēng)味物質(zhì)在上下層發(fā)酵酒醅中存在差異的主要因素。在復(fù)合香堆積過程中，堆積工序相當(dāng)于一個(gè)短暫的前發(fā)酵過程，不僅網(wǎng)羅培養(yǎng)了大量的微生物，還積累了生香前體物質(zhì)。所以控制好水分，以及堆積時(shí)間，使微生物正常生長繁殖，對于復(fù)合香調(diào)味酒的生產(chǎn)是至關(guān)重要的。