雷學(xué)俊，張 霞，劉多濤，李 智，羅青春，施 思，鄭 佳

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓 644007）

大曲作為一種多酶多菌的微生態(tài)制品，在傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒釀造過(guò)程中主要起提供菌源、糖化發(fā)酵、投糧作用和生香作用，又可稱之為白酒發(fā)酵的原動(dòng)力[1]。大曲的微生物主要包括霉菌、酵母菌、細(xì)菌、放線菌等四大類，其中霉菌是很重要的一類，其復(fù)雜而豐富的種類和數(shù)量賦予了大曲糖化、液化、蛋白分解等各種水解能力及酯化能力[2-3]。

五糧液包包曲是以其獨(dú)特的外形而命名，這種形狀獨(dú)特的包包曲造型使它接觸空氣的比表面積比一般大曲大，更有利于生產(chǎn)過(guò)程中自然有益微生物的繁殖、代謝，特別是霉菌微生物[4]。包包曲作為五糧液釀造過(guò)程中的糖化發(fā)酵劑，在不同溫度下形成不同的菌系、酶系，有利于酯化、生香和香味物質(zhì)的積累[5]。

多年來(lái)，關(guān)于大曲中霉菌的研究主要是利用傳統(tǒng)的形態(tài)和生理生化等經(jīng)典微生物學(xué)技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行霉菌的分類、優(yōu)勢(shì)菌及功能性霉菌的分離鑒定等，有效地詮釋了大曲中霉菌的多樣性，為白酒的個(gè)性化和品質(zhì)提升提供了理論依據(jù)。如張霞等[6]采用18S rRNA序列分析結(jié)合傳統(tǒng)分離鑒定法從貴州某知名酒廠的大曲中分離出歸屬于5個(gè)屬即曲霉屬（Aspergillus）、犁頭霉屬（Absidia）、假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、擬青霉屬（Paecilomyces）等104株絲狀霉菌，并確定MJ-10為煙曲霉（Aspergillus fumigatus），MJ-11為傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）。蘇暢等[7]通過(guò)ITS4/5 rRNA區(qū)序列進(jìn)行分析比對(duì)，分離鑒定出紅曲(Aspergillus ruber)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、嗜熱子囊菌(Thermomyces lanuginosus)、謝瓦氏曲霉(Aspergillus salwaensis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等13個(gè)種屬霉菌。方程等[8]通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合純培養(yǎng)的方法從高溫大曲中分離得到50株絲狀真菌，分別隸屬于Aspergillus、Monascus、Byssochlamys、Lichtheimia、Rhizomucor、Mucor、Arthrinium、Alternaria、Thermomyces和Rasamsonia等10個(gè)屬，并標(biāo)明這些絲狀真菌具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力。

本研究采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定手段對(duì)五糧液包包曲中主要霉菌進(jìn)行分離和鑒定，以此初步探討包包曲中霉菌的組成和系統(tǒng)發(fā)育情況，為保護(hù)包包曲中豐富的霉菌資源打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品來(lái)源

包包曲取自宜賓五糧液股份有限公司制曲車間，對(duì)曲房環(huán)境微生物及生產(chǎn)過(guò)程中0 d、3 d、5 d、9 d、30 d的包包曲進(jìn)行采集。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、察氏瓊脂（CDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器設(shè)備

電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；生化培養(yǎng)箱(LRH)，上海一恒科技儀器有限公司；電子天平(AL204)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 霉菌的分離與鑒定

1.2.1 分離純化

將包包曲磨碎混勻后取10 g加入到90 mL無(wú)菌生理鹽水中充分振蕩混勻后，取上清菌懸液1 mL到裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，采用10倍梯度稀釋涂布法進(jìn)行分離，選取10-3、10-4、10-5、10-64個(gè)梯度涂布平板，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，挑取明顯特征不同的單菌落進(jìn)行劃線純化分離，然后將其接種于試管斜面，置于4 ℃保藏備用。

曲房環(huán)境微生物的采集方法：將制備好的平板置于房間四個(gè)角落位置，每個(gè)位置放置3個(gè)平板。打開(kāi)平板蓋，放置5 min，利用空氣沉降法收集微生物，然后蓋上平板蓋，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，挑取明顯特征不同的單菌落進(jìn)行劃線純化分離，然后將其接種于試管斜面，置于4 ℃保藏備用。

1.2.2 菌株鑒定和歸類

1.2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[9]和《真菌鑒定手冊(cè)》[10]等將所有分離到的菌株進(jìn)行初步分類。然后使用乳酸石碳酸棉蘭染色液染色，鏡檢，記錄觀察目的菌株的形態(tài)特征。

1.2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：取純菌的菌體富集液5000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，采用SK8259（真菌）試劑盒操作進(jìn)行霉菌基因組DNA的提取。

PCR擴(kuò)增：采用真菌通用引物為NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'），PCR反應(yīng)體系包括0.5 μL的 基 因 組DNA、2.5 μL的5×Buffer（含Mg2+）、1 μL的dNTP、0.2 μL的聚合酶、0.5 μL的引物、0.5μL模板，加雙蒸水至25 μL，PCR循環(huán)條件為95 ℃、3 min預(yù)變性、94 ℃、30 s變性、55 ℃、25 s退火、72 ℃、1 min延伸、循環(huán)35次，72 ℃、5 min修復(fù)延伸，4 ℃終止反應(yīng)。經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出18S rRNA產(chǎn)物，用PCR及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序的后續(xù)工作。

1.3 霉菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，將測(cè)得的18S rRNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到的同源序列和測(cè)定序列在Clustal X軟件包中進(jìn)行分析，形成一個(gè)多重序列匹配排列陣導(dǎo)入MEGA5.0軟件，采用鄰位相連（Neighbor-Jioning）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 包包曲中可培養(yǎng)霉菌的分離

采用稀釋平板法從包包曲培養(yǎng)過(guò)程的曲樣中分離純化得到18株霉菌，依據(jù)其孢子結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)與顏色等將18株菌初步鑒定為A—I9大類群。

霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定包括霉菌的菌落特征和菌體孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)。初步歸類的9大類群的菌體具體菌落特征及孢子形態(tài)特征如圖1所示。

18株霉菌經(jīng)初步歸類為9大類群的具體形態(tài)特征描述如表1所示。

2.2 18S rRNA的PCR產(chǎn)物純化結(jié)果(圖2)

由圖2可知，已分離霉菌的18S rRNA的分子大小基本上都在1300 bp左右且亮度較高,說(shuō)明擴(kuò)增的片段與引物對(duì)的理論長(zhǎng)度基本一致，且產(chǎn)物濃度適合后續(xù)測(cè)序。

圖1 代表性霉菌的菌落結(jié)構(gòu)圖

表1 包包曲中分離到的霉菌

圖2 包包曲中部分霉菌18S rRNA的PCR純化片段電泳圖

2.3 包包曲中霉菌物種的18S rRNA分子鑒定

本研究選取不同時(shí)期包包曲樣本來(lái)研究包包曲中可培養(yǎng)霉菌的物種多樣性。根據(jù)不同類型的霉菌對(duì)其生長(zhǎng)繁殖時(shí)需求的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能不同，本研究采用3種不同類型的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和分離，其目的就是盡可能多的獲得霉菌物種。在篩選過(guò)程中，對(duì)于具有相似形態(tài)和生長(zhǎng)特征的霉菌，僅保留1株。最后共篩選分離得到19株霉菌。進(jìn)一步根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征，選取A類群菌株4株，B類群菌株3株，C、D、E、G、H類群菌株各1株，F(xiàn)類群菌株2株，I類群菌株4株共計(jì)18株。菌株的18S rRNA序列在NCBI中用BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)的菌株鑒定方法可鑒定出有差異的菌株，這9個(gè)類群又歸為9個(gè)大類群，其同源性分析結(jié)果見(jiàn)表2。各類群（代表菌株）編號(hào)分別為A（A1、A2）、B（B1、B2）、C、D、E、F、G、H（H1、H2）、I。

從表2可以看出，19株分離菌株大部分與已報(bào)道的菌株具有99 %以上的相似度，表明這些已分離菌株都已經(jīng)在NCBI中找到相似度非常高的菌株。不僅如此，B1菌株與米曲霉（Aspergillus oryzae）的相似度達(dá)到了100%，G1菌株與單孢根霉菌（Rhizopus azygosporus）的相似度達(dá)到了100 %，說(shuō)明菌株B1和菌株G1已經(jīng)鑒定到了種。

2.4 包包曲中霉菌物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

這9個(gè)類群中每一類群代表菌株的18S rRNA序列和用BLAST檢索到的與之有高度同源性菌株的18S rRNA序列，通過(guò)Clustal X軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3?？赏ㄟ^(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立對(duì)包包曲中分離出的不同類型的霉菌的種間親緣關(guān)系進(jìn)行了直觀界定。

表2 各類群代表菌株18S rRNA的同源性分析結(jié)果

在圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，包包曲分離得到的霉菌菌株的類別較為豐富，分別為青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、毛霉屬（Mucor）、尖鐮孢菌屬（Fusarium oxysporum）、刺孢小克銀漢霉（Cunninghamella echinulata）、根霉屬（Rhizopus）和Microstroma等9個(gè)已知霉菌屬，它們相互之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明包包曲中的霉菌有著很高的遺傳多樣性和種屬多樣性。

其中A1、A2等4株菌株聚為一支，且與灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、斜臥青霉（Penicillium decumbens）遺傳關(guān)系較近。B1、B2等3株菌株聚為一支，且分別與溜曲霉（Aspergillus tamarii）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillus terreus）聚在一起。H1、H2等5株菌株聚為一支，分別與傘狀橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）、分枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）遺傳關(guān)系相近。菌株C、D、E、F、G、I分別與絲衣霉屬（Byssochlamy.sp）、尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium）、白地霉（Galactomyces candidum）、刺孢小克銀漢霉（Cunninghamella echinulata）、小單孢根霉菌（Rhizopus microsporus）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和Microstroma phylloplanum各單獨(dú)聚為一支。

基于以上結(jié)果說(shuō)明，基于可培養(yǎng)的方法在目前微生物群落研究中仍然發(fā)揮著不可替代的作用。

圖3 基于18S rRNA全序列為基礎(chǔ)的包包曲中霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

五糧液和瀘州老窖作為濃香型白酒的典型代表，釀造生產(chǎn)均是大曲。五糧液釀造生產(chǎn)用曲為包包曲，屬于中溫偏高溫曲，是以純小麥為原料，生料制曲，自然接種，皮薄心厚，濃香純正，發(fā)酵周期短，頂溫中溫偏高溫，最高溫可達(dá)63 ℃；而瀘州老窖釀造生產(chǎn)用曲為中高溫大曲，是以純小麥和高粱為原料，制曲最高溫達(dá)到65 ℃。原料與溫度等不同造就大曲中微生物種類存在較大差異[12]。研究者們針對(duì)不同區(qū)域的中高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)研究表明[13]，霉菌尤其是根霉是曲塊側(cè)面和曲包表層的優(yōu)勢(shì)類群，曲心的優(yōu)勢(shì)菌群主要是芽孢桿菌，曲塊底面主要是青霉和犁頭霉，而黃曲霉、紅曲霉在曲塊各部位均存在。王彩虹等[14]采用ITS基因文庫(kù)法分析得到瀘州老窖中高溫大曲的優(yōu)勢(shì)霉菌群落為掃帚狀曲霉、米根霉、微小根毛霉等曲霉屬和根霉屬。姚萬(wàn)春等[13]從瀘州老窖國(guó)窖曲中分離的霉菌有根霉、毛霉、梨頭霉、黃曲霉、青霉和紅曲霉等6類霉菌。本次研究的包包曲分離鑒定出刺孢小克銀漢霉、尖鐮孢菌屬、絲衣霉菌屬和Microstroma屬等種類，極大地豐富了中高溫大曲中霉菌屬種類。

大曲中糖化酶和液化酶活力的高低與大曲中微生物尤其是霉菌的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)[15]，而糖化力和酯液化力是衡量大曲質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。趙東等[16]揭示了五糧液包包曲發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系的變化與其理化因子在演變過(guò)程中的關(guān)系，為提高包包曲質(zhì)量提供理論依據(jù)。故系統(tǒng)全面研究大曲中優(yōu)勢(shì)霉菌種類有助于提高大曲質(zhì)量，進(jìn)而提高出酒率。

本研究中，采用了PDA培養(yǎng)基、CDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基對(duì)五糧液包包曲中的霉菌微生物進(jìn)行稀釋分離，并對(duì)獲得的純培養(yǎng)菌種進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。研究結(jié)果表明，濃香型包包曲內(nèi)存在大量青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、橫梗霉屬、刺孢小克銀漢霉、尖鐮孢菌屬、絲衣霉菌屬等主要霉菌類群，極大的豐富了對(duì)濃香型包包曲中霉菌菌株的認(rèn)識(shí)。此外采用18S rRNA全序列進(jìn)行霉菌的分子鑒定可將大多數(shù)的霉菌鑒定到屬。