梁小娟 周 蕓 羅仕琴

廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科 518020

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期婦女常見疾病，嚴重威脅著母嬰的健康。其發(fā)病機制涉及許多因素。微小RNA(microRNA，miRNA)是具有18～22個核苷酸的小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究證實miRNA在組織中的表達異常與先兆子癇和妊娠期糖尿病密切相關(guān)。miR-144與miR-451已經(jīng)被證明參與了胰腺β細胞的增殖與凋亡，并與2型糖尿病胰島素抵抗相關(guān)，但miR-144與miR-451在妊娠期糖尿病血漿中的表達及作用尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 資料收集 收集我院2016年9月—2017年9月就診的妊娠期糖尿病孕婦35名，并按年齡匹配的方法收集同期就診的正常孕婦35名。妊娠期糖尿病診斷標準：于妊娠24周進行葡萄糖耐量試驗，禁食8h，檢查空腹狀態(tài)下的血糖指標，隨后再口服75g的葡萄糖。診斷要點：(1)空腹血糖≥5.0mmol/L；(2)餐后1h血糖≥10mmol/L；(3)餐后2h血糖≥8.5mmol/L；(4)使用75g OGTT實驗測量血糖。1h≥8.6mmol/L，2h≥6.7mmol/L，3h≥5.8mmol/L。只要其中一點滿足要求就可診斷為妊娠期糖尿病。排除標準主要包括：(1)妊娠前存在糖尿病或有糖尿病家族史；(2)年齡<18歲；(3)有異常妊娠家族史；(4)有胎兒染色體或重大畸形家族史；(5)嚴重的全身性疾病。所有參與者均簽署了知情同意書，實驗方法得到本院倫理委員會批準，該研究得到了深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科健康與人類研究倫理委員會的批準，并獲得了參與者的書面知情同意書。

1.2 樣本采集 采集24周正常孕婦及確診為妊娠期糖尿病孕婦外周血2ml，并在28周、32周再次留取確診的妊娠期糖尿病孕婦外周血2ml；同時計算24周時確診妊娠期糖尿病孕婦的體重指數(shù)(BMI)、胰島素抵抗指數(shù)以及血清糖化血紅蛋白含量。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵指數(shù)(HOMA-IR)計算如下：(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5；體重指數(shù) BMI = 體重(kg)/身高2(m)。

1.3 miRNA提取和實時定量PCR 將血液樣品收集到含有EDTA的采血管中，4℃ 3 000g離心5min分離血漿。使用RNeasy plus mini試劑盒(Qiagen)從200μl血漿中分離總RNA。NanoVue plus(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)測量總RNA濃度和純度。按照GeneCopoeia公司“All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit”操作說明，取1～3μg RNA建立20μg逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。GeneCopoeia公司的“miRNA qPCR Kit”試劑盒和ABI7500 Fast Real-time PCR擴增儀進行熒光擴增。U6作為內(nèi)參，采用ΔCt(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進行相對定量分析，以2-ΔΔCt作為目的RNA的相對表達量。miR-144、miR-451及U6上游引物購自廣州富能公司。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析，計量資料均經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用LSD-t檢驗分析兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計；Spearman的相關(guān)分析用于評估m(xù)icroRNA和風險因素之間的相關(guān)性。P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 35名GDM孕婦及35名非GDM孕婦的臨床特點如表1所示，GDM孕婦在24周時HbA1c、HOMA-IR及BMI均高于正常孕婦，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 兩組臨床特點比較

2.2 miR-144及miR-451在GDM孕婦血漿中表達增高 qPR-PCR方法檢測24周GDM孕婦與正常孕婦血漿中miR-144與miR-451的表達，如圖1與圖2所示，miR-144及miR-451在GDM孕婦中較正常孕婦明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 miR-144及miR 451在GDM孕婦血漿中的表達進行性升高 qPR-PCR方法檢測24周、28周及32周GDM孕婦血漿中miR-144與miR-451的表達，如圖3與圖4所示，miR-144及miR-451表達隨妊娠時間的延長進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 GDM孕婦miR-144表達Spearman相關(guān)性分析 分析妊娠24周時妊娠期糖尿病孕婦血漿中miR-144表達量與BMI、HbA1c及HOMA-IR的相關(guān)性。結(jié)果如表2及圖5、圖6所示，miR-144血漿中的表達量與HOMA-IR和HbA1c正相關(guān)，而與BMI無明顯相關(guān)性。

表2 miRNA與妊娠期糖尿病高危因素相關(guān)性分析(R/P)

圖5miR-144表達量與HOMA-IR的相關(guān)性分析

2.5 妊娠期糖尿病孕婦miR-451表達Spearman 相關(guān)性分析 分析妊娠期糖尿病孕婦在妊娠24周時miR-145表達量與BMI、HbA1c及HOMA-IR的相關(guān)性。結(jié)果如表2及圖7所示，妊娠期糖尿病孕婦血漿中miR-451在表達量與HOMA-IR正相關(guān)，而與BMI及HbA1c無明顯相關(guān)性。

3 討論

妊娠期糖尿病是指妊娠前糖代謝正?；蛘呖赡艽嬖跐撛诘钠咸烟悄土拷档?，而在懷孕期間首次確診為糖尿病，是婦產(chǎn)科常見疾病之一，嚴重威脅母嬰健康[1]。對于孕婦而言，主要風險是剖宮產(chǎn)、先兆子癇以及增加2型糖尿病發(fā)病風險[2]；對于胎兒而言，巨大兒、低血糖、難產(chǎn)、呼吸窘迫綜合征和胎兒死亡嚴重威脅胎兒及嬰兒健康[3]。目前妊娠期糖尿病主要治療方法是運動療法、飲食控制和胰島素替代治療，以減少糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，改善孕婦預(yù)后[4]。目前臨床上妊娠期糖尿病診斷依據(jù)依賴于美國糖尿病協(xié)會(ADA)和糖尿病和妊娠研究組(IADPSG)標準診斷[5]。診斷通常在懷孕24～28周進行，有時可延遲至32周。因此，迫切需要精確和迅速的預(yù)測和診斷妊娠期糖尿病的方法，提早對妊娠期糖尿病孕婦進行干預(yù)，以改善孕婦的預(yù)后。

許多研究尋找可能預(yù)測妊娠期糖尿病的潛在的生物學標記，包括早期妊娠中期基因表達變化，表觀遺傳學修飾及非編碼RNA的改變[6]。然而，這些生物標志物存在一些局限性。微小RNA是具有18～22個核苷酸的小的非編碼RNA，通過與靶基因的3’UTR相結(jié)合，抑制靶基因的翻譯或者促進靶基因mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達[7]。且相關(guān)研究證實，外周血中的微小RNA與組織中的微小RNA相似[8]。又由于miRNAs在外周血中很穩(wěn)定，易于收集，因此miRNAs已被作為診斷與預(yù)后的生物學標志在多種疾病上得到應(yīng)用，包括腫瘤、心血管疾病及糖尿病[9-11]。然而，當妊娠24～28周診斷出GDM時，血漿microRNAs是否可用作GDM的診斷生物標志物尚不清楚。

Zhao等證實，miR-29a、miR-132、miR-222在早期診斷等妊娠期糖尿病患者外周血中表達下降[12]；Cao也發(fā)現(xiàn)，在24～28周妊娠期糖尿病患者的外周血中miRNA-16-5p、miR-17-5p及miR-20a-5p表達明顯升高，并可能與妊娠期糖尿病的高危因素相關(guān)[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與正常孕婦相比，妊娠24周時GDM孕婦血漿miR-144以及miR-451表達明顯上調(diào)，且隨著妊娠時間進展，兩種miRNA表達進行升高。提示著miR-144與miR-451可能在妊娠期糖尿病疾病發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。

一些研究表明，患有GDM的孕婦比健康孕婦具有更高的體重指數(shù)，糖化血紅蛋白含量和胰島素抵抗，并將這些指標確定為妊娠期糖尿病的危險因素[14-15]。因此，在本研究中，筆者進一步分析血漿miR-144和miR-451是否與妊娠期糖尿病危險因素相關(guān)。結(jié)果顯示miR-144與miR-451均與HOMA-IR呈正相關(guān)。miR-451及mi144是一種參與多種生物過程的miRNA，它通過靶向不同基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用，調(diào)控的腫瘤等增值及凋亡；此外，miR-451能夠通過抑制CD4+T細胞增殖在炎癥中發(fā)揮作用。重要的是， 有研究證實miR-451在懷孕大鼠的胰島中上調(diào)，體外過表達miR-451保護β細胞免受細胞因子和棕櫚酸誘導的大鼠胰島細胞凋亡。另外miR-144也證實參與胰腺β細胞抗凋亡作用[16-18]。因此推測miR-144與miR-451可能參與了妊娠期糖尿病抵抗。但其在妊娠期糖尿病中的作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，與正常妊娠孕婦相比，妊娠期糖尿病孕不同時間血漿miR-144及miR-451表達明顯增加，并且與胰島素抵抗呈正相關(guān)，miR-144及miR-451可能作為診斷妊娠期糖尿病等生物學標志。