王健 朱甲婧 孫嘉翊 王婷 杜愛林

便秘是一種常見的胃腸運動障礙性疾病。由于各種因素(飲食，年齡，地理分布，居住區(qū)域，職業(yè)等)影響，便秘發(fā)病率近幾年來呈上升趨勢[1]，大黃素具有抗腫瘤活性、抗微生物生長作用、免疫抑制作用和瀉下利尿作用[2]。蘆薈大黃素(aloe emodin，AE)與大黃素是同分異構體，AE也有抗腫瘤活性、抗菌活性、免疫抑制和瀉下作用[3]。目前現有文獻僅局限于腫瘤活性，對瀉下有關的作用在國內還未報道。已有研究表明：P物質(P substance，SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)可作為作為胃腸運動調節(jié)中重要的興奮性和抑制性胃腸肽，廣泛分布在胃腸道中[4]。SP是興奮性神經遞質，能刺激腸道運動并抑制胃腸道黏膜分泌[5]。血管活性腸肽是腸神經系統(tǒng)(ENS)中的一種抑制性神經遞質，能夠松弛胃腸道，是參與腸蠕動調節(jié)的重要蛋白。SP是興奮性神經遞質，能刺激腸道運動并抑制胃腸道黏膜分泌[5]。因此本課題將進一步研究AE對結便秘小鼠腸組織中SP及VIP表達的影響，探究其治療便秘的作用機制，同時為新藥開發(fā)提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物 取30只小鼠，平均分為三組，對照組、模型組、AE組，10只/組。

1.2 實驗試劑 復方地芬諾酯片(江蘇平光制藥有限責任公司，批號：170032，2.5 g/片)，硫酸鋇混懸液(美侖生物，CAS號：7727-43-7)，烏拉坦腹腔注射麻醉(0.3 mL/只)，AE(美侖生物，批號：N1026A)等。

1.3 主要儀器 BL-420F生物機能試驗系統(tǒng)，自制銅絲電極直徑0.5 mm，長度4 mm，注射器、灌胃針頭、電子秤、電熱板、計時器、眼科剪、刻度尺、鑷子、量筒、燒杯等。

1.4 造模 取30只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，測量每只小鼠連續(xù)4 d飲水量及大便量，計算此批小鼠正常每日飲水量均數，得出每日大便量的正常范圍，然后開始限水加給藥物進行造模。給藥方法：將藥物混入蒸餾水中給小鼠進行灌胃。給藥量：復方地芬諾酯片25 mg/kg(小鼠用量按成人用量的9倍計算)。限水水量：于第1～2天給前1周平均水量的1/6，第3～6天給前1周平均水量的1/3，取整數值。為了避免再次灌胃操作對小鼠排便的影響，我們對小鼠實行普通飲水瓶手持輔助飲水方法。2次/d給水。對照組灌胃等量的蒸餾水，排除灌胃操作帶來的影響干擾。記錄每日排便量、粒型大小、干燥程度。以糞便干燥、粒形縮短、排便費力、日排量低于參考值范圍為診斷小鼠便秘的標準。

1.5 對小鼠腸道傳輸功能的檢測 對小鼠大便情況的測定：配制140%的硫酸鋇混懸液。停藥7 d后，禁食14 h，用硫酸鋇混懸液按1 mL/100 g的劑量給小鼠灌胃并準確計時，給藥后觀察小鼠第一次排出白便的時間，連續(xù)觀察6 h，記錄小鼠排便的粒數，糞便的干重(收集的糞便在25～27 ℃的電熱板上烤6 h)。結腸肌電生理變化測定：首先禁食小鼠24 h，注射20%烏拉坦腹腔麻醉(0.3 mL/只)，而后將其仰臥置于手術臺，常規(guī)消毒，縱行沿下腹部正中切開1.5 cm，顯露回盲部，于距盲腸約1 cm(結腸近段)放置一對銅絲電極(兩電極插入漿肌層內，彼此相距0.5 cm)，導線經切口引出接BL-410F生物機能實驗系統(tǒng)，于30 min后開始記錄。靈敏度選擇：增益倍數放大500倍、高頻濾波為20 Hz、時間常數0.001 s，連續(xù)記錄45 min，重復3次。

1.6 結腸肌電活動參數分析 以3 min為1個時間段，分別記錄比對振幅和頻率的平均值、標準差以及變異系數。

慢波振幅變異系數(%)＝慢波振幅標準差/慢波振幅均值×100%

慢波頻率變異系數(%)＝慢波頻率標準差/慢波頻率均值×100%

1.7 免疫組織化學技術 各組小鼠均只給予水24 h，對于小鼠進行麻醉處死，通過腹腔注射的方法，注射5%水合氯醛(0.1 mL/10 g)，之后取小鼠近段結腸，用4%的多聚甲醛溶液固定小鼠的組織，一定梯度的乙醇脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度為5 μm。常規(guī)脫蠟復水，采用DAB染色，把二抗稀釋為200倍，最后使用樹膠封存玻片晾干。在顯微鏡下觀察SP和VIP的染色情況，陽性細胞的判定方法，以細胞中存在有被染為褐色的顆粒為標志。選擇合適的視野，避開重疊或者不完整的，用Image pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計分析每個視野的平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 用照相系統(tǒng)在光鏡下采集免疫組化圖片，用Image pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計平均光密度值，SP和VIP表達情況用Excel進行統(tǒng)計分析，用(±s)表示。

2 結果

2.1 三組小鼠排便情況的測定(表1) 建模后，AE組及模型組小鼠的糞便較對照組小鼠的糞便重量減輕、濕度降低、硬度增大。模型組小鼠及AE組小鼠6 h內排便粒數較對照組較大幅度減小，第一次排紅便時間長，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 三組小鼠排便情況的測定(±s)

表1 三組小鼠排便情況的測定(±s)

注：與對照組比較，#P＜0.01。

組別例數第一次排紅便時間/min 6 h排便粒數對照組10174.38±7.5973.89±6.56模型組10379.56±23.17#29.51±6.02#AE組10220.12±13.87#65.25±5.77#

2.2 三組小鼠結腸肌電活動(表2，圖1) 三組小鼠的結腸慢波呈正弦波樣曲線。三組小鼠的結腸慢波表現與正弦波樣曲線相接近。模型組結腸慢波頻率為(47.97±2.63)次/min，與對照組(43.75±0.69)次/min相比明顯加快，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，AE組結腸慢波頻率與模型組比較明顯減慢，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；模型組結腸慢波頻率變異系數(6.02±0.23)%，與對照組(1.83±0.38)%相比明顯增大(P＜0.01)，AE組小鼠頻率變異系數(2.77±0.19)%，與模型組相比更趨于正常(P＜0.01)；模型組結腸慢波振幅(0.05±0.03)mV，與對照組(0.16±0.03)mV相比顯著減少(P＜0.01)，AE組振幅(0.13±0.03)mV，與模型組相比明顯回升(P＜0.01)；模型組結腸慢波振幅變異系數(62.79±1.71)%，與對照組(10.13±0.55)%相比明顯增大(P＜0.01)，AE組小鼠振幅變異系數(25.31±1.97)%，與模型組相比明顯減小(P＜0.01)。

表2 三組小鼠結腸慢波頻率、振幅比較(±s)

表2 三組小鼠結腸慢波頻率、振幅比較(±s)

注：與模型組比較，#P＜0.01。

組別例數頻率/(次·min-1)頻率變異系數/%振幅/mV振幅變異系數/%對照組1043.75±0.69#1.83±0.38#0.16±0.03#10.13±0.55#模型組1047.97±2.636.02±0.230.05±0.0362.79±1.71 AE組1043.84±1.19#2.77±0.19#0.13±0.03#25.31±1.97#

圖1 三組小鼠結腸肌電圖(A：正常組小鼠結腸肌電圖；B：模型組小鼠結腸肌電圖；C：AE組小鼠結腸肌電圖)

2.3 三組小鼠結腸SP表達變化(圖2A～2C，表3)與正常對照組比較，模型組小鼠結腸SP表達明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；AE組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖2A 對照組小鼠結腸SP 陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

圖2B 模型組小鼠結腸SP 陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

圖2C AE組小鼠結腸SP 陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

表3 三組小鼠結腸SP 表達變化(±s)

表3 三組小鼠結腸SP 表達變化(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.01。

組別例數結腸中SP平均光密度值對照組100.045 2±0.007 0*模型組100.023 1±0.004 9 AE組100.040 5±0.002 2*

2.4 三組小鼠結腸VIP表達變化(圖3A～3C，表4)與正常對照組比較，模型組表達明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；AE組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖3A 對照組結腸組織VIP 的陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

圖3B 模型組結腸組織VIP 的陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

圖3C AE組結腸組織VIP 的陽性表達免疫組化DAB染色(×40)

表4 三組小鼠結腸組織中VIP 平均光密度值(x±s)

3 討論

便秘是一種常見的胃腸運動障礙性疾病。在臨床中，便秘是一種很常見的癥狀，但目前國內外文獻并沒有對其病因有明確說明和解釋。

有研究表明[6]，便秘患者結腸推進性收縮波數目和收縮幅度均有所減低，糞便在腸道有所潴留。結腸能促進排泄糞便，便秘常被認為是結腸動力異常引起的。結腸的肌電動作電位是在慢波的基礎上產生的，與平滑肌收縮頻率相同，是推進性運動的核心動力。結腸的動力情況可由結腸肌電活動，電生理指標進行客觀顯示。研究表明：慢波作為可控制腸道收縮節(jié)律的一種周期性電活動是相對規(guī)律而穩(wěn)定的，腸道收縮或否，慢波始終存在[7]。

本實驗通過使用復方地芬諾酯建造小鼠的便秘模型，用AE對小鼠進行灌胃治療1周后，結果顯示：模型組與對照組小鼠比較，6 h大便量減少，推動率降低，說明便秘模型建立成功。而AE組與模型組相比，第一次排紅便時間減少，6 h大便量增多，推動率增加，說明AE對便秘小鼠有通便的作用。模型組與對照組小鼠相比，慢波振幅減少且慢波振幅變異系數增大，慢波頻率增快且慢波頻率變異系數增大，振幅和頻率皆有極大差異。該現象的發(fā)生提示便秘有可能是因為動作電位產生受阻從而削弱了腸道的傳輸能力，而AE組與模型組小鼠相比，其慢波頻率減少，慢波振幅小幅度上升。此外，為了衡量節(jié)律的穩(wěn)定性，我們應用了變異系數這一參數來反映同組小鼠不同時間段振幅和頻率的差異[8]。結果 顯示，便秘小鼠的慢波振幅變異系數及慢波頻率變異系數與對照組相比均有所增長，該結果提示便秘小鼠的結腸肌電生理活動出現了一定程度上的紊亂。AE作用于便秘小鼠后其慢波振幅變異系數及慢波頻率變異系數較之前明顯趨于正常，提示AE對增加便秘小鼠的結腸推進性收縮波數目有一定的作用。收縮幅度的提升可使糞便在結腸中排泄的速度加快，能有效緩解結腸的動力異常。但AE在有效改善便秘的同時，是否能夠長久持續(xù)穩(wěn)定地增加收縮波的數目而導致腸道收縮節(jié)律的紊亂，目前尚無定論，仍需進一步研究。

SP為一種重要的神經肽，廣泛地分布于腸神經系統(tǒng)和整個胃腸道，既可以激素的形式，也可作為神經遞質參與胃腸道運動的調控[5]。在腸道神經叢及神經元中存在著SP這種蛋白，它作為一種具有興奮作用的神經遞質，能夠調節(jié)腸道的運動。一些研究者發(fā)現，產生便秘的原因和SP的多少有關系，且SP越少較容易產生便秘[9-10]。SP屬于胃腸肽中的速激肽族，具有強烈地促進消化道平滑肌收縮、刺激結腸黏膜分泌水和電解質，促進胃腸蠕動的作用。已有研究表明，80%的便秘患者結腸平滑肌中缺乏SP[11]。

VIP是腸神經系統(tǒng)中最具代表性而且研究得比較深入的神經遞質，在胃腸調節(jié)中起重要的作用。其受體廣泛分布于人和動物的多種組織器官上[12]。VIP是腸道神經系統(tǒng)主要的抑制性遞質。VIP是廣泛存在的腦腸肽，在消化系統(tǒng)中十二指腸和結腸含量最高[13]，能松弛腸道平滑肌，抑制胃腸的運動[12]。VIP與結腸的節(jié)段非推進性運動有關，參與調節(jié)腸道動力及腸黏膜的機械化學免疫屏障[14]。VIP作為一種多效性作用的神經遞質，具有擴張血管、降低血壓的特點[15]，對消化道平滑肌的收縮產生抑制作用[16]。VIP濃度降低，可能引起結腸出現過度的節(jié)段性蠕動，使有效推動運動減弱。由于VIP濃度異常改變，使腸道正常運動生化功能的完整性被破壞，腸道運動功能失調，從而引起便秘[5]。

結腸的運動形式比較復雜，結腸的節(jié)段性運動使腸內容物得到混合攪拌，推進性運動將腸內容物從一個結腸段推送到相鄰的遠端結腸。陶春虹[16]研究表明，枳實能明顯提高慢傳輸型便秘腸神經遞質SP和VIP含量，促進腸運動。實驗便秘模型組SP、VIP含量明顯低于空白對照組(P＜0.01)，便秘模型小鼠腸道SP含量降低提示便秘小鼠的腸道收縮功能減弱，這可能是導致結腸動力減弱而發(fā)生便秘的原因之一，便秘模型小鼠腸道VIP含量降低提示VIP 表達降低使結腸階段性蠕動增強，導致有效推動性運動減弱，從而引起大便排出困難。

AE對模型小鼠肌間神經叢SP、VIP含量增加有明顯的促進作用，表明大黃素的促腸道動力作用與結腸SP、VIP分布增加存在著密切關系，可能與本組方有促進腸神經叢結構和功能恢復有關，其作用機制尚需進一步深入研究。大黃素是否對結腸其他胃腸激素、酶類及神經遞質也產生影響，還需作更深入的研究。本研究結果為大黃素的臨床應用提供了一定的實驗依據。