譚佳妮 ， 劉文豪 ， 沈衛(wèi)星 ， 程海波

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，國(guó)家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗(yàn)方評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省抗腫瘤驗(yàn)方與產(chǎn)業(yè)化工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

結(jié)直腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，其發(fā)病率在全球男性和女性惡性腫瘤類型中分別列第2位和第3位[1]，死亡率居第2位[2]，結(jié)直腸癌晚期重要臟器轉(zhuǎn)移是其主要的死亡原因。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年上升，其發(fā)病速度為世界平均速度的2倍[3-4]。中醫(yī)藥在結(jié)直腸的預(yù)防與治療中扮演著越來越重要的角色，從中醫(yī)藥中發(fā)掘有效的預(yù)防結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)及藥物已是近年的研究重點(diǎn)。消癌解毒方是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授結(jié)合多年的臨床實(shí)踐形成的臨床有效驗(yàn)方，該方由白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、莪術(shù)、太子參、麥冬等組成，具有清熱散結(jié)、消癌解毒，化痰祛瘀、益氣養(yǎng)陰、扶正抗癌的功效。既往關(guān)于消癌解毒方的臨床與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等多種消化道腫瘤具有確切療效，可以提高患者抗腫瘤的免疫功能，與西醫(yī)常規(guī)惡性腫瘤治療方案比較，聯(lián)合用藥在改善中晚期惡性腫瘤患者生命質(zhì)量與緩解中醫(yī)癥狀方面具有明顯的效果[5-7]。本研究在前期臨床效應(yīng)基礎(chǔ)上，體外觀察了消癌解毒方含藥血清抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用，從細(xì)胞周期改變的角度探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。人結(jié)直腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細(xì)胞株用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素）于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及制備 消癌解毒方組成中藥材均購(gòu)自亳州國(guó)苑中藥材飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鄒立思教授鑒定為道地藥材。于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室煎制：稱取復(fù)方中各藥材后，加入10倍藥量的水，煎煮2次（分別為2、1.5 h），收集、合并2次濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積，最終成2 g/mL濃度的濾液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27、Notch1、Hes1等抗體（美國(guó)Abcam公司）；ECL檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo公司）。FACSCantoTM流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ProwerPacTMBasic凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Tanon-5500化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（天能科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及含藥血清制備 清潔級(jí)雄性新西蘭兔2.0～2.2 kg，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0008。將兔隨機(jī)分為對(duì)照組、給藥組，每組2只。給藥組給予消癌解毒方煎液灌胃，劑量為40 g/kg（為臨床給藥劑量的5倍），每日分2次灌服；對(duì)照組給予灌服等體積生理鹽水。2組均連續(xù)灌胃5 d，末次給藥前12 h禁食不禁水。給藥2 h后，異氟烷麻醉，頸總動(dòng)脈取血。室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心5 min分離血清，合并同組血清，56℃滅活30 min，0.22μmol/L微孔濾膜除菌，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/mL加入96孔板中，100μL/孔，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中。24 h棄掉培養(yǎng)上清后，加入體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%的消癌解毒方含藥血清100μL/孔。設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（OD，D）值。根據(jù)D值計(jì)算各含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

1.5.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，分別加入5%、10%、15%消癌解毒方含藥血清，孵育48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.5.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/mL加入96孔板中，1 mL/孔，置于37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中。24 h后棄掉培養(yǎng)上清，加入體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%的消癌解毒方含藥血清2 mL/孔。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。給藥結(jié)束后，胰酶消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中4℃固定過夜，以1 000 r/min離心5 min后用1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，離心棄上清后加入500μL染色液[25μL碘化丙啶（PI）染色液+10μL RNase]37℃避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，用Kaluza Analysis軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量及光散射分析。

1.5.4 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27及Notch1/Hes1信號(hào)途徑相關(guān)蛋白Notch1、Hes1表達(dá)的檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，分別加入5%、10%、15%消癌解毒方含藥血清，孵育48 h后，收集空白組細(xì)胞及處理后的細(xì)胞，用Western及IP裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白。用BCA法定量蛋白，調(diào)整蛋白濃度后置于95℃金屬浴中變性10 min。10%～12%分離膠和5%濃縮膠十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，100 g/L脫脂牛奶37 ℃封閉2 h。一抗（CyclinA2，1∶2 000； CyclinB1，1∶2 000；CDK1，1∶2 000；P21，1∶2 000；P27，1∶1 000；Notch1，1∶1 000；Hes1，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗膜3次后，室溫孵育二抗1 h，最后應(yīng)用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑進(jìn)行顯色，應(yīng)用GelAnalysis軟件進(jìn)行條帶分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)比較各組差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響 表1關(guān)于CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，消癌解毒方含藥血清處理人結(jié)腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細(xì)胞48 h后，HT-29、HCT-116及LoVo細(xì)胞的存活率均有不同程度的降低，且該抑制作用隨著含藥血清濃度的增大而增強(qiáng)。15%含藥血清對(duì)HT-29、HCT-116及LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用分別為（37.64±1.62）%、（58.69±2.68）%及（38.54±2.95）%?？梢姡琀CT-116細(xì)胞對(duì)含藥血清最敏感。因此，我們選擇HCT-116細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察給予含藥血清后HCT-116細(xì)胞形態(tài)的變化，結(jié)果如圖1所示：正常HCT-116細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞伸展，呈密集型或重疊生長(zhǎng)；給予含藥血清后，細(xì)胞呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀、核裂碎、胞膜皺縮、間距變大。隨著含藥血清濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)改變的情況越明顯。

表1 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of CTR-containing serum on the proliferation of colorectal cancer cells （-x±s，n=6）

2.3 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的影響 PI可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA及RNA結(jié)合，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度即可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)DNA含量。細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期DNA含量是不同的，因此通過PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行檢測(cè)就可以將細(xì)胞周期的各時(shí)相區(qū)分開來。給予含藥血清處理后，HCT-116細(xì)胞周期分布情況如圖2、表2所示：與空白對(duì)照組比較，G2/M期細(xì)胞數(shù)隨含藥血清濃度增加而增加（P＜0.01），S和G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期尤其明顯（P＜0.05或P＜0.01）。提示消癌解毒方含藥血清能劑量相關(guān)性地誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

圖1 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Figure 1 The effect of CTR-containing serum on the morphological features of HCT-116 colorectal cancer cells（×200）

2.4 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)及Notch1信號(hào)通路的影響 采用Western Blot法檢測(cè)消癌解毒方含藥血清對(duì)G2/M期周期相關(guān)蛋白以及周期依賴性蛋白激酶抑制劑表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3、表3所示，消癌解毒方含藥血清能明顯下調(diào)CDK1、CyclinA2、CyclinB1等促進(jìn)細(xì)胞周期的蛋白并上調(diào)P21、P27等抑制周期進(jìn)程的蛋白。同時(shí)，我們檢測(cè)了給予含藥血清后的HCT-116細(xì)胞內(nèi)Notch1信號(hào)通路蛋白水平的變化，結(jié)果如圖3、表3所示，隨含藥血清劑量的增加，Notch1及Hes1蛋白表達(dá)逐漸減少。提示消癌解毒方含藥血清可能通過抑制Notch1/Hes1通路抑制周期相關(guān)性蛋白的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。

圖2 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞周期分布的影響Figure 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells

表2 消癌解毒方含藥血清對(duì)結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞周期分布的影響Table 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells （-x±s，n=3）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)直腸癌（大腸癌）是在脾氣虧虛的基礎(chǔ)上，因外感濕邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等內(nèi)外多種因素的誘導(dǎo)而生成癌毒，與濕、熱、瘀等病理因素交雜復(fù)合，搏結(jié)于腸道，傷及腸腑，形成癌腫，導(dǎo)致腸腑通降失司的病變。因此，結(jié)直腸癌的基本病機(jī)是濕熱瘀毒、脾氣虧虛。消癌解毒方是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授結(jié)合多年的臨床實(shí)踐形成的有效驗(yàn)方。方中：白花蛇舌草、半枝蓮為君藥，清熱散結(jié)、消癌解毒；山慈菇、莪術(shù)為臣藥，化痰祛瘀、消腫散結(jié)；太子參、麥冬為佐使，益氣養(yǎng)陰、扶正抗癌。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：在體內(nèi)，消癌解毒方通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡顯著抑結(jié)直腸癌CT-26細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤的增殖[8-9]；在體外，消癌解毒方含藥血清抑制結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解過程抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10]，但尚缺乏相關(guān)機(jī)制的深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著消癌解毒方含藥血清濃度的增加，HCT-116細(xì)胞增殖活性顯著下降。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，消癌解毒方含藥血清增加了HCT-116細(xì)胞G2/M期比例，降低了G0/G1及S期細(xì)胞比例，使結(jié)直腸細(xì)胞HCT-116阻滯于G2/M期。表明消癌解毒方抑制HCT-116細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

圖3 消癌解毒方含藥血清對(duì)細(xì)胞周期蛋白及Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 The effect of CTR-containing serum on the expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins

Notch1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在結(jié)直腸癌形成過程中具有致癌基因作用[11]，且在腫瘤組織中的高表達(dá)與化療耐藥及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[12-13]。Notch1信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡有廣泛的調(diào)控作用。Edelmann等報(bào)道，Notch1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)參與慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞周期調(diào)控[14]。此外，在肝癌等的進(jìn)展過程中，Notch信號(hào)通路還參與了肝癌細(xì)胞周期的調(diào)控[15]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western Blot檢測(cè)了周期相關(guān)蛋白及Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示消癌解毒方含藥血清通過抑制Notch1/Hes1信號(hào)通路，增加了HCT-116細(xì)胞G2/M期比例，使結(jié)直腸細(xì)胞阻滯于G2/M期從而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步明確了消癌解毒方抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。本研究可為消癌解毒方的臨床開發(fā)與應(yīng)用奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

表3 消癌解毒方含藥血清對(duì)細(xì)胞周期蛋白及Notch1通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)的影響Table 3 The effect of CTR-containing serum on the relative expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins （-x±s，n=3，p）