王欣俞，丁曉娜，趙晉文，崔 凱，潘 杰，王鑫琪，張延海，高德祿，郭奕陽，馬海娜※

(1.河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 廊坊 065201； 2.河北燕達(dá)醫(yī)學(xué)研究院，河北 廊坊 065201；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050011)

梅毒是由梅毒螺旋體(treponema pallidum，TP)感染引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。其可侵犯全身機(jī)體，導(dǎo)致急性皮膚感染、生殖器潰瘍、脊髓病變、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全、主動(dòng)脈瘤、麻痹性癡呆、視神經(jīng)萎縮，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致患者死亡[2-3]。梅毒的傳染途徑主要為性接觸，其可呈現(xiàn)進(jìn)展型發(fā)病趨勢(shì)，但臨床癥狀和體征不具有特異性，故加強(qiáng)早期診斷意義重大[4]。TP侵襲力極強(qiáng)，可破壞患者表皮或黏膜屏障的完整性，使人類免疫缺陷病毒更易進(jìn)入和排出宿主，導(dǎo)致梅毒患者感染或傳播人類免疫缺陷病毒的風(fēng)險(xiǎn)增加4～5倍，從而促進(jìn)人類免疫缺陷病毒的感染和傳播[5]。由于TP具有無法在體外連續(xù)培養(yǎng)、基因操作困難、細(xì)胞膜易碎難以提取等缺點(diǎn)[6]，也無有效疫苗，故早期篩查與診斷梅毒具有重要價(jià)值[7]。目前，梅毒的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查包括梅毒的暗視野顯微鏡檢查、梅毒血清學(xué)檢測(cè)、梅毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)等。由于梅毒暗視野顯微鏡檢查和梅毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)受實(shí)驗(yàn)條件、梅毒病程影響，檢出率不高，所以臨床最常用的檢測(cè)方法為梅毒血清學(xué)檢測(cè)[8]。本研究通過分析130例梅毒篩查弱反應(yīng)性結(jié)果，旨在探討實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法在臨床結(jié)果判讀診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性納入2018年1月至2019年6月在河北燕達(dá)醫(yī)院體檢中心、門診和住院部進(jìn)行全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(chemiluminescence microparticle immunoassays，CMIA)梅毒實(shí)驗(yàn)室血清篩查的38 331例患者，選取S/CO值1～9弱反應(yīng)性且快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性的130例患者作為研究對(duì)象，其中男62例，女68例，年齡28～89歲，平均(57±13)歲，年齡集中在45～60歲。人群分布：老年人31例，男15例，女16例；神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病24例，男11例，女13例；心血管相關(guān)疾病23例，男15例，女8例；腫瘤相關(guān)性疾病19例，男10例，女9例；孕婦14例；感染性相關(guān)疾病8例，男3例，女5例；風(fēng)濕免疫相關(guān)性疾病7例，男5例，女2例；體檢人群4例，男3例，女1例。

1.2試劑與儀器 CMIA檢測(cè)試劑(批號(hào)：9331LI00)由美國(guó)雅培公司生產(chǎn)，其配套儀器為全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)雅培公司，型號(hào)：Architect i2000SR)；化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)檢測(cè)試劑(批號(hào)：128058)由德國(guó)西門子公司生產(chǎn)，其配套儀器為全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國(guó)西門子公司，型號(hào)：ADVIA Centaur XP)；梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(treponema pallidumm particle agglutination，TPPA)檢測(cè)試劑購自日本富士瑞必歐株式會(huì)社(批號(hào)：WN81019)；梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)(treponema pallidum-western blot，TP-WB)檢測(cè)試劑盒購自德國(guó)歐蒙公司(批號(hào)：D180619AG)。梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)按標(biāo)準(zhǔn)化操作文件執(zhí)行。檢測(cè)樣本時(shí)，同測(cè)室內(nèi)質(zhì)控品及陰、陽性對(duì)照，以保證監(jiān)控檢測(cè)質(zhì)量。

1.3方法 采用CMIA初篩檢測(cè)TP特異性抗體，快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)排除梅毒活動(dòng)期，選用TPPA和CLIA進(jìn)行復(fù)核，以TP-WB為金標(biāo)準(zhǔn)確證方法。CMIA法試劑說明書中，以S/CO值(樣本RLU/cut-off RLU)≥1檢驗(yàn)結(jié)果解釋TP抗體檢測(cè)呈反應(yīng)性，S/CO值<1檢驗(yàn)結(jié)果解釋TP抗體檢測(cè)呈非反應(yīng)性；快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)測(cè)定梅毒非特異性抗原，是檢測(cè)梅毒現(xiàn)正感染和療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)?？焖傺獫{反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)陽性反應(yīng)判讀可見中等或較大的黑色凝塊，溶液清亮；陰性反應(yīng)判讀可見均勻的抗原顆粒而無凝集物。TPPA和CLIA為TP特異性抗體復(fù)檢方法(TPPA陽性反應(yīng)判讀產(chǎn)生均一的凝集，顆粒鋪滿整個(gè)孔底邊緣不均勻且雜亂地凝集在周圍，整體上呈膜狀延展；陰性反應(yīng)判讀反應(yīng)物集中于孔底，成紐扣狀聚集，邊緣光滑的圓形。CLIA S/CO值≥1檢驗(yàn)結(jié)果解釋TP抗體檢測(cè)呈反應(yīng)性，S/CO值<1檢驗(yàn)結(jié)果解釋TP抗體檢測(cè)呈非反應(yīng)性)。TP-WB為實(shí)驗(yàn)室平行試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)方法中重組TP基因蛋白抗原采用TPN47、tmpA(TPN45)、TPN17、TPN15的IgG抗體，是測(cè)定的血清特異性抗體。檢測(cè)膜條置于全自動(dòng)免疫印跡儀EUROBlotMasterll檢測(cè)，通過EUROLineScan軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀，至少兩條特異性抗原帶明確顯色，測(cè)試判讀陽性；一條特異性抗原帶明確顯色，測(cè)試判讀可疑陽性。EUROLineScan軟件判讀結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為著色強(qiáng)度≥24判定有反應(yīng)性，檢測(cè)線性范圍為0～255。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8 Contingency table analyses組件的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行不同診斷方法的差異分析；相關(guān)性分析采用Excel 2016進(jìn)行散點(diǎn)最小二乘擬合，得到線性關(guān)系式并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.14種梅毒實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)結(jié)果比較 130例CMIA初篩梅毒檢測(cè)的S/CO值為1～9弱反應(yīng)性樣本，以CLIA復(fù)核，92例陽性，38例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.586，特異度為1.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.532，P<0.001)；以TPPA復(fù)核，98例陽性，32例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.570，特異度為1.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.491，P<0.001)；TPPA復(fù)核結(jié)果和CLIA方法相比，靈敏度為0.516，特異度為0.543，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.704，P=0.402)；以TP-WB平行檢測(cè)作為確證方法，40例反應(yīng)性結(jié)果，其中8例陽性，32例可疑陽性，90例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.942，特異度為1.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=229.943，P<0.001)。以TP-WB梅毒血清方法學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，CLIA法靈敏度為85.0%，特異度35.6%；TPPA法靈敏度為85.0%，特異度為28.9%。見表1。

表1 CLIA、TPPA和TP-WB檢測(cè)TP抗體的結(jié)果 (例)

CLIA：化學(xué)發(fā)光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)；TP-WB：梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)；TP：梅毒螺旋體

2.2CMIA與CLIA法的相關(guān)性分析 130例弱反應(yīng)性結(jié)果分別采用CMIA及CLIA法復(fù)核，相關(guān)性分析顯示CMIA與CLIA法結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.588，P<0.001)。見圖1。

圖1 CMIA與CLIA法相關(guān)性分析

2.3TP-WB確認(rèn)結(jié)果抗體表達(dá) 40例TP-WB確認(rèn)結(jié)果顯示判讀8例陽性結(jié)果，抗體表達(dá)為2個(gè)條帶并著色強(qiáng)度低；32例判讀可疑陽性結(jié)果，抗體表達(dá)單一且著色強(qiáng)度明顯降低。見表2。

3 討 論

近年來，梅毒在我國(guó)的感染率呈逐年上升趨勢(shì)[9]，對(duì)我國(guó)的公共衛(wèi)生事業(yè)有很大影響[10]，國(guó)家衛(wèi)生行政部門越來越重視，患者本身意識(shí)越來越高。然而在臨床工作中，實(shí)驗(yàn)方法存在差異性。文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于TP特異性抗體篩查陽性而甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)檢測(cè)陰性的老年患者需進(jìn)行TP-WB

表2 40例標(biāo)本免疫印跡檢測(cè)結(jié)果不一致的匯總 (例)

CMIA：化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法；CLIA：化學(xué)發(fā)光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)；TP-WB：梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)；TP：梅毒螺旋體；-∶陰性；+∶陽性；±∶可疑陽性

確證檢測(cè)并結(jié)合臨床癥狀、體征和病史，做出最后診斷[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，TP感染會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生兩類抗體：一類為抗TP的特異性抗體，是宿主針對(duì)TP多種膜蛋白或軸絲抗原等成分產(chǎn)生；另一類為非特異性血清反應(yīng)素抗體，即抗心磷脂抗體，在TP感染過程中抗心磷脂抗體表達(dá)增加，隨著治療的進(jìn)行其水平會(huì)降低，臨床常用血清學(xué)方法檢測(cè)抗心磷脂抗體滴度反映梅毒疾病活動(dòng)性[13]。梅毒抗體無免疫保護(hù)作用，在臨床上僅用于梅毒血清學(xué)的診斷[13]。TP感染機(jī)體后，宿主最早產(chǎn)生的抗體是IgM，然后是IgG和IgA。由于IgM變化比較明顯，故臨床常將其作為梅毒血清學(xué)診斷的標(biāo)志物[14]；IgG抗體是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，在二期梅毒中表達(dá)最強(qiáng)烈，是血清和細(xì)胞外液中最主要的抗體成分[15]。人體感染TP 4～10周后，血清中會(huì)產(chǎn)生非TP抗體，即抗心磷脂抗體，其產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為是因?yàn)榧?xì)胞受到損傷，線粒體釋放心磷脂，作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體；也有學(xué)者認(rèn)為是因?yàn)門P本身具有心磷脂，所以引起抗心磷脂抗體的產(chǎn)生[16]。經(jīng)規(guī)范治療后，反應(yīng)素可以逐漸減至陰性，但梅毒特異性抗體IgG不易消退，甚至終身陽性；未經(jīng)治療的梅毒患者，反應(yīng)素會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng)期存在[17]。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞2介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答是造成梅毒長(zhǎng)期潛伏感染的主要原因[18]。梅毒外膜蛋白是免疫的主要靶點(diǎn)，TP15、TP17、TP45、TP47被認(rèn)為在梅毒的診治中起重要作用[19]。有研究表明，TP47是含量較高的外膜脂蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)性；TP17可以激活內(nèi)皮細(xì)胞[20]，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)[21]，在TP免疫致病機(jī)制中具有重要作用。

但當(dāng)結(jié)果為弱反應(yīng)性，梅毒實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)存在結(jié)果不一致時(shí)首先要考慮生物學(xué)假陽性反應(yīng)或生理因素的影響。梅毒血清學(xué)檢測(cè)生物學(xué)假陽性見于自身免疫性疾病、病毒性感染性疾病、心血管性疾病、腫瘤、炎癥患者及生理情況孕婦、老年人等。文獻(xiàn)報(bào)道，老年人群出現(xiàn)生物學(xué)假陽性的原因可能為隨著年齡的增加，生理功能退化，基礎(chǔ)疾病增多，機(jī)體產(chǎn)生了自身抗體、抗類脂抗體或異常蛋白，也可能存在其他螺旋體亞型的感染，使TP抗體檢測(cè)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，從而產(chǎn)生生物學(xué)假陽性[22-27]。張曉紅等[28]研究顯示，97份TPPA檢測(cè)陰性血清樣本，TP-WB確證反應(yīng)性結(jié)果占25.8%,TPPA是采用針對(duì)TP15、TP45抗體純化的致病性TP抗原，所以TP15、TP45的抗體效價(jià)降低或僅有TP17、TP47抗體時(shí)，TPPA可能會(huì)無法正確得出陽性結(jié)果。

本研究回顧性分析130例弱反應(yīng)性的梅毒患者中，孕婦人群、老年人群、患有基礎(chǔ)疾病特殊人群(年齡集中在45～60歲)等的CMIA、CLIA、TPPA檢測(cè)結(jié)果不一致，梅毒篩查實(shí)驗(yàn)方法學(xué)不同廠家應(yīng)用抗原成分及人群分布會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽性、假陰性。本研究CMIA與CLIA法的相關(guān)性分析表明，兩種方法檢測(cè)結(jié)果存在高度一致性，同時(shí)出現(xiàn)假陽性的可能性較高。因此，即使兩種方法結(jié)果均呈現(xiàn)較高的陽性值時(shí)也需采用特異性和穩(wěn)定性更好地方法進(jìn)行確證。目前，梅毒檢測(cè)中大部分實(shí)驗(yàn)室以TPPA進(jìn)行補(bǔ)充復(fù)核，但易導(dǎo)致臨床診斷的誤診或漏診。本研究結(jié)果顯示，以TP-WB檢測(cè)方法確證，陽性結(jié)果抗體表達(dá)為2個(gè)條帶并著色強(qiáng)度低，可疑結(jié)果中抗體表達(dá)單一著色強(qiáng)度明顯降低；TPPA陰性人群中TP-WB抗原帶顯示僅為一個(gè)條帶，著色強(qiáng)度在檢測(cè)的線性范圍下限。

綜上所述，臨床主要通過檢測(cè)患者血清學(xué)特異性抗體和非特異性抗體水平作為梅毒診斷及預(yù)后評(píng)估的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。免疫印跡檢測(cè)TPN15、TPN17、TPN45、TPN47抗體在弱反應(yīng)人群梅毒血清檢測(cè)結(jié)果中以可疑陽性多見，故梅毒實(shí)驗(yàn)室臨床確證在臨床診斷中對(duì)于弱反應(yīng)人群尤為重要。