馮淑嫻，王 歌

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院安寧分院婦產(chǎn)科，蘭州 730070； 2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)療系，長沙 410083)

目前，免疫治療是腫瘤治療的有效手段。T淋巴細(xì)胞具有極強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用[1]。近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤治療中基因改造T細(xì)胞的發(fā)展迅速。單鏈抗體技術(shù)與T細(xì)胞活化基序結(jié)合應(yīng)用的免疫治療技術(shù)可精確靶向并持久殺傷腫瘤細(xì)胞、改變腫瘤免疫抑制微環(huán)境、破壞宿主免疫耐受狀態(tài)，并可為過繼性細(xì)胞免疫治療提供新的有效解決方案，成為腫瘤免疫治療的有效方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細(xì)胞是目前臨床免疫治療的主要細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞可有效消除腫瘤干細(xì)胞亞群及其他腫瘤細(xì)胞，在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應(yīng)[2-4]。CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用廣泛，但仍存在很多風(fēng)險(xiǎn)，在臨床治療中，準(zhǔn)確找到腫瘤特異性靶點(diǎn)、改善免疫抑制微環(huán)境、有效控制CAR-T細(xì)胞成為目前腫瘤免疫治療的首要目標(biāo)?，F(xiàn)就近年來CAR-T細(xì)胞的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

CAR的胞外配體結(jié)合域由單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)組成，可通過跨膜區(qū)與胞內(nèi)信號(hào)域連接[5]。CAR技術(shù)的基本原理是將scFv與T細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)序列拼接，再通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體、DNA轉(zhuǎn)座子、電穿孔等技術(shù)進(jìn)行基因編輯?；赗NA[CRISRP(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/caspase-9]及蛋白質(zhì)(鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶)的基因編輯技術(shù)可有效敲除抑制性基因或誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞功能增強(qiáng)分子的表達(dá)。CAR與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合可活化CAR-T細(xì)胞，表現(xiàn)為CAR依賴的殺傷、增殖及細(xì)胞因子釋放。

CAR的結(jié)構(gòu)一共經(jīng)歷了四代發(fā)展[6]。第一代CAR將scFv與免疫球蛋白Fc受體的γ鏈或CD3復(fù)合體的ζ鏈融合，形成CAR-T細(xì)胞受體。第一代CAR-T細(xì)胞無共刺激分子，在體內(nèi)存活時(shí)間較短，將協(xié)同刺激因子與CAR融合可活化共刺激分子和胞內(nèi)信號(hào)域，增強(qiáng)T細(xì)胞功能。二代CAR-T細(xì)胞可在CD3結(jié)構(gòu)域的上游融合1個(gè)協(xié)同刺激因子(如CD27、CD28、OX40、ICOS、4-1BB等)，三代CAR-T細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)域可融合多個(gè)協(xié)同刺激因子。三代CAR-T細(xì)胞活化、增殖、分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒素的作用更強(qiáng)，對(duì)三代CAR-T細(xì)胞親和力較低的分子也可促使三代CAR-T細(xì)胞的活化，但效果尚不確定。四代CAR-T細(xì)胞(也稱為TRUCK細(xì)胞)還可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)，如分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞及機(jī)體免疫細(xì)胞的功能[7]。

2 影響CAR-T細(xì)胞治療效果的因素及解決方法

2.1脫靶效應(yīng) 許多腫瘤抗原不僅在癌細(xì)胞高表達(dá)，還可在正常組織少量表達(dá)，增加了發(fā)生免疫治療脫靶殺死正常細(xì)胞的可能性，并可能發(fā)生交叉反應(yīng)而靶向抗原結(jié)構(gòu)相似的其他組織。設(shè)計(jì)串聯(lián)性CAR是提高特異性的方法之一，串聯(lián)性CAR由兩個(gè)串聯(lián)的靶向不同抗原的scFv組成，只有同時(shí)結(jié)合兩種抗原才能活化T細(xì)胞[8]。此外，還可通過T細(xì)胞共刺激或共抑制受體識(shí)別T細(xì)胞組合信號(hào)改善治療效果的自主控制，減少脫靶效應(yīng)。

與門邏輯設(shè)計(jì)的雙抗原CAR-T細(xì)胞可表達(dá)攜帶CD3ζ鏈以及攜帶共刺激基序的兩種CAR，只有兩種CAR同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞才能被完全激活并增殖[9]。與此相反，以非門邏輯設(shè)計(jì)的抑制性CAR是利用共抑制受體程序性細(xì)胞死亡受體-1或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈取代CAR胞質(zhì)尾部的刺激性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)抑制性CAR與同時(shí)表達(dá)CAR和抑制性CAR抗原的細(xì)胞結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞活性被抑制[10]。此方法需要進(jìn)一步鑒定潛在脫靶組織的特異性抗原，以確定抑制性CAR的靶向抑制性抗原。

或門邏輯在CAR-T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原中也具有重要作用。在腫瘤免疫編輯過程中，腫瘤細(xì)胞可通過抑制特異性抗原的表達(dá)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，或門邏輯設(shè)計(jì)的CAR可靶向B細(xì)胞CD19和CD20抗原，使缺失CD19的CAR仍具有抗腫瘤作用[11]。

有研究開發(fā)了synNotch(synthetic Notch)受體[12]。Notch蛋白為跨膜受體，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng)Notch蛋白與關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外配體結(jié)合并誘導(dǎo)膜內(nèi)蛋白水解后，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被切割釋放。synNotch受體保留了Notch受體中控制配體依賴性切割及胞質(zhì)尾釋放的最小跨膜核心結(jié)構(gòu)域，而其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分別由scFvs和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如Gal4-VP64或tetR-VP64)取代。synNotch受體技術(shù)作為與門識(shí)別的新方法，通過激活配體誘導(dǎo)CAR的表達(dá)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞殺傷作用。因此，在局部腫瘤微環(huán)境中，synNotch受體與抗原結(jié)合前的T細(xì)胞無細(xì)胞毒性成為識(shí)別抗原的更安全選擇。

細(xì)胞內(nèi)腫瘤標(biāo)志物一般不作為抗原，但其特異性較細(xì)胞外抗原更強(qiáng)。細(xì)胞內(nèi)抗原通過主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，T細(xì)胞受體具有識(shí)別細(xì)胞內(nèi)抗原的能力，但T細(xì)胞受體的固有低親和性以及腫瘤細(xì)胞表面低密度的主要組織相容性復(fù)合體分子限制了T細(xì)胞受體的臨床應(yīng)用。與低親和力T細(xì)胞受體相比，T細(xì)胞受體樣抗體不僅保留了T細(xì)胞受體的特異性，還具有高親和性。研究發(fā)現(xiàn)，多種T細(xì)胞受體樣抗體可靶向腫瘤及病原體衍生的多種主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ肽復(fù)合體[13]。目前，已經(jīng)研發(fā)出具有親和力的腎母細(xì)胞瘤抗原1(由人類白細(xì)胞抗原A2呈遞)人抗體[14]。在構(gòu)建CAR時(shí)結(jié)合高親和力T細(xì)胞受體樣抗體，并將細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物作為潛在靶標(biāo)，可提高CAR-T細(xì)胞免疫治療的特異性及安全性，但其對(duì)脫靶效應(yīng)的識(shí)別潛力仍有待驗(yàn)證。

2.2細(xì)胞控制 細(xì)胞控制是CAR-T細(xì)胞療法需要解決的主要難題之一。T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞均可導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體健康，因此基本細(xì)胞控制對(duì)細(xì)胞免疫治療的成敗十分重要。將自殺基因?qū)隒AR-T細(xì)胞是控制細(xì)胞治療效果的方法之一。自殺基因指某些病毒或細(xì)菌中具有催化無毒藥物前體，并使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)的酶的基因。將自殺基因?qū)氚屑?xì)胞可導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞死亡，如單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷自殺基因系統(tǒng),胸苷激酶可催化丙氧鳥苷生成有細(xì)胞毒性的核苷酸，阻止DNA合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的自殺基因可將無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化為高毒性代謝產(chǎn)物，以殺傷腫瘤細(xì)胞，但其具有以下缺點(diǎn)：①病毒蛋白有免疫原性；②有效的DNA整合才能使腫瘤細(xì)胞的消除生效；③ T細(xì)胞清除需要的時(shí)間較長；④在單純皰疹病毒胸苷激酶基因中存在耐藥突變。

通過修飾免疫細(xì)胞信號(hào)傳遞通路是控制CAR-T細(xì)胞治療的另一方法。研究表明，icaspase-9包含一個(gè)FKBP12-F36V藥物結(jié)合域和一個(gè)caspase-9胞內(nèi)段。FK506類似物(AP1903/AP20187)可誘導(dǎo)FKBP12-F36V的二聚化，激活caspase-9和凋亡通路，迅速驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞凋亡[15]。此外，通過敲除人表皮生長因子受體胞外結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ及其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并保留含有西妥昔單抗結(jié)合位點(diǎn)，可產(chǎn)生截短的人表皮生長因子受體，可見西妥昔單抗驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞毒性作用可清除表達(dá)CAR和截短的人表皮生長因子受體的T細(xì)胞[16]。但通過清除T細(xì)胞控制腫瘤發(fā)展的治療效果存在一定局限性：①若CAR-T治療造成患者損傷，即使清除99%的CAR-T細(xì)胞也無法完全抑制細(xì)胞的毒性作用；②若T細(xì)胞對(duì)藥物不敏感，即機(jī)體不表達(dá)相應(yīng)受體，則無法清除腫瘤細(xì)胞；③患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞清除后，可能導(dǎo)致治療終止或失敗。

調(diào)節(jié)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)能力是控制細(xì)胞活性的另一種方式，可通過將受體的配體結(jié)合域與胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈分開來實(shí)現(xiàn)，即“ON-switch CAR”，抗原和二聚化藥物同時(shí)存在才可激活，改變藥物濃度可有效調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞的殺傷力和增殖活性[17]。與自殺基因控制相比，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)可更有效地控制治療性T細(xì)胞，但受到固定表達(dá)CAR的限制。小分子適配器可控制T細(xì)胞活性，如構(gòu)建結(jié)合Fc結(jié)構(gòu)的CD16V-BB-ζ抗體。小分子適配器無抗腫瘤作用，在體內(nèi)與Fc結(jié)合后可促使T細(xì)胞激活，未經(jīng)適配器刺激的細(xì)胞會(huì)“沉默”，不識(shí)別和靶向任何細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，含有異硫氰酸熒光素[18]或抗多肽新抗原表位[19]的腫瘤抗原特異性抗體適配器分子可以劑量滴定方式控制CAR-T細(xì)胞的活性、組織浸潤、細(xì)胞因子釋放和表型。通過使用不同的適配器分子可使CAR-T細(xì)胞靶向不同抗原，并通過構(gòu)建細(xì)胞因子受體控制T細(xì)胞功能。

2.3免疫抑制微環(huán)境 腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用是長期的動(dòng)態(tài)變化過程，腫瘤發(fā)生伴隨免疫監(jiān)視、免疫平衡、免疫逃逸3個(gè)階段，最終建立腫瘤免疫抑制微環(huán)境。免疫抑制微環(huán)境可影響CAR-T細(xì)胞的活性，抑制其抗腫瘤作用，改變腫瘤免疫抑制微環(huán)境對(duì)提高CAR-T細(xì)胞的療效十分重要。

解除免疫檢查點(diǎn)對(duì)T細(xì)胞的抑制作用是改變免疫抑制微環(huán)境的有效措施之一，如將程序性細(xì)胞死亡受體-1跨膜和胞質(zhì)尾部替換為共刺激域，在結(jié)合檢查點(diǎn)分子后可促進(jìn)細(xì)胞的激活或使用程序性細(xì)胞死亡受體-1/程序性細(xì)胞死亡配體1抗體。目前，一些實(shí)驗(yàn)致力于通過CRISPR/caspase-9技術(shù)[23]使T細(xì)胞不表達(dá)程序性細(xì)胞死亡受體-1。此外，使用CRISPR/caspase-9進(jìn)行異體基因敲除而產(chǎn)生的通用CAR-T細(xì)胞，有可能改善目前CAR-T細(xì)胞的療效。

細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)展與免疫活動(dòng)中有重要作用，通過T細(xì)胞修飾可使T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子受體基因或細(xì)胞因子基因，有助于改善免疫抑制微環(huán)境。有實(shí)驗(yàn)顯示，IL-7在體外和體內(nèi)均支持IL-7Rα、GD2特異性CAR、EB病毒特異性T細(xì)胞的增殖和抗腫瘤活性，且存在全功能調(diào)節(jié)性T細(xì)胞時(shí)也是如此[24]。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IL-4胞外區(qū)的T細(xì)胞可被腫瘤產(chǎn)生的抑制性細(xì)胞因子IL-4激活，且僅在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生，避免了CAR-T細(xì)胞對(duì)正常組織造成損傷[25]。IL-15可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活，激活人記憶CD8+T細(xì)胞的端粒酶活性[26]，并在T細(xì)胞表達(dá)時(shí)，促進(jìn)干細(xì)胞記憶表型[27]。

另外，賦予CAR-T細(xì)胞主動(dòng)重構(gòu)腫瘤微環(huán)境的能力，如使CAR-T細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-12、IL-2、IL-15等均顯示T細(xì)胞在腫瘤抑制性微環(huán)境中能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過基因修飾可使CD19的CAR-T細(xì)胞表達(dá)單純皰疹病毒受體，其與配體結(jié)合后可改善免疫抑制微環(huán)境[28]。synNotch受體是誘導(dǎo)刺激性細(xì)胞因子、趨化因子、抗體(包括檢查點(diǎn)抑制劑)、雙特異性抗體和先天性免疫刺激分子等表達(dá)的有效載體[29]。因此，可以通過synNotch受體設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞，以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞識(shí)別腫瘤和重構(gòu)腫瘤微環(huán)境的能力。

2.4CAR-T細(xì)胞的浸潤 與血液腫瘤相比，CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的浸潤更困難，這可能是CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤治療效果不佳和易復(fù)發(fā)的原因。不同給藥途徑在CAR-T細(xì)胞實(shí)體腫瘤浸潤中所起的作用不同，如采用胸腔內(nèi)注射的抗間皮素CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效優(yōu)于全身使用[30]。另一方面，CAR-T細(xì)胞可主動(dòng)改變腫瘤微環(huán)境，提高CAR-T細(xì)胞的浸潤。研究發(fā)現(xiàn)，體外擴(kuò)增的T細(xì)胞可下調(diào)乙酰肝素酶信使RNA的表達(dá)，使T細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的能力降低。通過T細(xì)胞表達(dá)乙酰肝素酶可使輸注的T細(xì)胞更好地降解實(shí)體腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，提高其浸潤能力[31]。此外，CAR-T細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體還可增強(qiáng)腫瘤浸潤。研究表明，BLT1和CXCR3通過促進(jìn)CD8+T細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的遷移來調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫[32]。除響應(yīng)天然配體外，研究還設(shè)計(jì)了能向生物惰性小分子定向遷移的T細(xì)胞[33]。通過對(duì)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體T細(xì)胞的基因修飾，促使T細(xì)胞向生物惰性小分子氯氮平-N-氧化物遷移，此模式中，受體不響應(yīng)天然配體，惰性藥物不結(jié)合天然細(xì)胞，T細(xì)胞的靶向能力得到提高。

3 結(jié) 語

CAR-T細(xì)胞免疫療法作為免疫治療的新技術(shù)已成功應(yīng)用于血液腫瘤治療，為實(shí)體腫瘤患者的治療帶來新希望。然而，CAR-T免疫療法在實(shí)體腫瘤的應(yīng)用還面臨諸多困難。實(shí)體腫瘤的異質(zhì)性決定了其治療必須與細(xì)胞本身的特點(diǎn)、作用規(guī)律等因素相結(jié)合。目前，研究人員正試圖通過多方面的探索尋找更多的腫瘤抗原，以提高靶點(diǎn)的特異性或選擇多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行治療；通過進(jìn)一步對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的遷移浸潤，解除腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性，最終提高CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的抗腫瘤效果。隨著合成生物學(xué)和基因組工程的不斷發(fā)展，模塊化基因編碼工具的開發(fā)將推動(dòng)CAR-T細(xì)胞治療的不斷完善，從而促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)細(xì)胞免疫治療的發(fā)展。