★ 常欣峰 宋春花 龍笑影 韓立民**（.贛南醫(yī)學(xué)院 江西 贛州 34000；.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 江西 贛州 34000）

心肌肥厚以心肌細(xì)胞肥大及心肌間質(zhì)異常為基本病理改變，是心臟對(duì)血流壓力負(fù)荷增加的主要代償機(jī)制，主要見(jiàn)于高血壓[1]與血管疾病[2]。心肌病理性重構(gòu)是心力衰竭的主要發(fā)病機(jī)制之一，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度激活是心肌病理性重構(gòu)、心衰的發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。本研究采用異丙腎上腺素（Isoproterenol，Iso）誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型，擬觀察化痰活血益氣復(fù)方的抗心肌肥厚作用及對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌因子血管緊張素（angiotensinⅡ，AngⅡ）、醛固酮（aldosterone，ALD）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）及Akt信號(hào)磷酸化水平的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重200～250g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013—0004，飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物 化痰活血益氣方（法半夏10g、陳皮10g、葶藶子15g、酒丹參20g、生黃芪20g、茯苓15g、炙甘草3g）由贛南醫(yī)學(xué)院科研中心提供，經(jīng)稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至0.9765g/mL（含生藥）。葶藶子、陳皮、茯苓購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，半夏、甘草購(gòu)自江西樟樹(shù)慶仁中藥飲片有限公司，丹參購(gòu)自江西樟樹(shù)彭氏國(guó)藥堂飲片有限公司，黃芪購(gòu)自安徽普仁中藥飲片有限公司?？ㄍ衅绽?gòu)自江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑 Iso（貨號(hào)：I5627-5G）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，AngⅡ（貨號(hào)：CEA005Ra）、ALD（貨號(hào)：CEA911Ge）、ET-1（貨號(hào)：CEA482Ra）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司，p-Akt（貨號(hào)：9271S）、Akt（貨號(hào)：9272S）及β-Tubulin（貨號(hào)：2128S）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號(hào)：ZB-2301）抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立、分組及給藥 48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、復(fù)方低劑量組、復(fù)方中劑量組、復(fù)方高劑量組和卡托普利組，每組8只。各組（除正常組）大鼠背部皮下注射Iso 1mg/kg，每日1次，連續(xù)10d；正常組大鼠背部皮下注射等劑量的生理鹽水。自由進(jìn)食，飲水。于造模次日，各治療組開(kāi)始灌胃給藥，每日兩次，每次間隔8h以上，連續(xù)14d。復(fù)方低、中、高劑量組和卡托普利組分別灌胃以化痰活血益氣方4.88，9.77，19.53mg/kg/d和卡托普利0.02mg/kg/d。給藥量按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]所示體表面積劑量換算法計(jì)算，復(fù)方低、中、高劑量和卡托普利分別給予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效劑量，正常組、模型組灌胃以相同體積的生理鹽水。

2.2 心臟指數(shù)測(cè)定 末次給藥后禁食、不禁水12h，稱重，10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g，i.p.），腹主動(dòng)脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，冰上去除心房組織、分離左右心室，濾紙吸干后，稱量左心室重、全心重。計(jì)算左心室重量指數(shù)（left ventricle mass index，LVMI） = 左心室重量（mg）/體重（g），全心重量指數(shù)（heart mass index，HMI） = 全心重量（mg）/體重（g）。

2.3 ELISA法檢測(cè)血清AngⅡ、ALD、ET-1含量 腹主動(dòng)脈采血，置于4℃冰箱中保存，待凝血堅(jiān)實(shí)、血清析出后，4℃ 3500 r/min離心10min，分離血清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次檢測(cè)血清AngⅡ、ALD、ET-1的含量。

2.4 Western blot法檢測(cè)心肌組織Akt蛋白水平及其活性形式p-Akt蛋白水平的表達(dá) 取50μg心肌組織蛋白樣本，經(jīng)電泳、濕法轉(zhuǎn)膜后，分別孵以一抗p-Akt（1∶200）、Akt（1∶400）及β-Tubulin（1∶1000），4℃轉(zhuǎn)移搖床過(guò)夜。TBST清洗后，孵以對(duì)應(yīng)二抗（1∶1000），室溫水平搖床搖晃1h后，行化學(xué)發(fā)光。用Image Lab 5.1軟件測(cè)量蛋白條帶面積并進(jìn)行灰度分析，計(jì)算p-Akt/Akt比率。β-Tubulin作為內(nèi)參使用。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化痰活血益氣方對(duì)心臟指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組的LVMI與HMI均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，復(fù)方中劑量組的LVMI與HMI均明顯降低（P＜0.05），卡托普利組的LVMI明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化痰活血益氣方對(duì)心臟指數(shù)的影響（）

表1 化痰活血益氣方對(duì)心臟指數(shù)的影響（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 劑量/mg·kg-1·d-1 LVMI/mg·g-1 HMI/mg·g-1正常組 8 — 2.06±0.09 2.64±0.11模型組 4 — 2.64±0.09* 3.37±0.16*復(fù)方低劑量組 5 4.88 2.50±0.11 3.25±0.12復(fù)方中劑量組 5 9.77 2.45±0.11# 3.09±0.18#復(fù)方高劑量組 6 19.53 2.54±0.10 3.29±0.14卡托普利組 5 0.02 2.47±0.09# 3.24±0.14

異丙腎上腺素可以興奮心肌β1腎上腺素受體，增快心率、增強(qiáng)心肌收縮力，增加心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的傳導(dǎo)速度，縮短竇房結(jié)的不應(yīng)期，升高血壓以增加心臟壓力負(fù)荷，為心肌肥厚的常用造模藥物。經(jīng)查閱，中文文章所用異丙腎上腺素多為國(guó)產(chǎn)，動(dòng)物死亡率相對(duì)較低。本實(shí)驗(yàn)所用異丙腎上腺素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司且為近期生產(chǎn)，藥效好且質(zhì)量有保證。在本實(shí)驗(yàn)中，給大鼠皮下注射異丙腎上腺素后大鼠出現(xiàn)了心跳加快、心臟驟停乃至猝死等現(xiàn)象，大鼠死亡乃造模藥物藥效反應(yīng)、機(jī)體不能代償所致。正常組、模型組及給藥組大鼠死亡數(shù)目不一，正常組無(wú)死亡，模型組死亡最多，治療組死亡較少，可能與治療藥物干預(yù)有關(guān)。

3.2 化痰活血益氣方對(duì)神經(jīng)體液因子的影響 與正常組相比，模型組的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，復(fù)方低、中劑量組和卡托普利組的血清AngⅡ水平，復(fù)方中劑量組的血清ALD水平以及復(fù)方中劑量組和卡托普利組的血清ET-1水平均明顯降低（P＜0.05）；在各治療組中，復(fù)方中劑量組的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平均為最低。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 化痰活血益氣方對(duì)神經(jīng)體液因子的影響（）

表2 化痰活血益氣方對(duì)神經(jīng)體液因子的影響（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 劑量/mg·kg-1·d-1 AngⅡ/pg·mL-1 ALD /pg·mL-1 ET-1 /pg·mL-1正常組 8 — 160.86±85.11 38.40±22.98 89.54±12.34模型組 4 — 422.53±83.31** 95.55±26.05** 142.03±11.35**復(fù)方低劑量組 5 4.88 267.85±104.47# 59.08±28.80 129.04±11.02復(fù)方中劑量組 5 9.77 247.17±74.19# 48.95±18.81# 113.43±15.32#復(fù)方高劑量組 6 19.53 327.57±79.12 79.93±23.56 137.79±13.15卡托普利組 5 0.02 261.83±51.60# 54.25±22.24 119.32±11.50#

3.3 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt、Akt蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt比率的影響

3.3.1 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt、Akt蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，各組p-Akt蛋白的表達(dá)水平存在顯著性差異。與正常組比較，模型組的p-Akt條帶面積明顯增大；與模型組比較，復(fù)方低、中、高劑量組的p-Akt條帶面積有不同程度的減小，卡托普利組的p-Akt條帶面積無(wú)明顯增減。在各治療組中，復(fù)方中劑量組的p-Akt條帶面積最小。各組Akt、β-Tubulin蛋白的表達(dá)水平未見(jiàn)顯著性差異。

圖2 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt、Akt、β-Tubulin蛋白表達(dá)的影響

3.3.2 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt/Akt比率的影響 本實(shí)驗(yàn)每組取4只大鼠，每只大鼠重復(fù)2次。與正常組比較，模型組的p-Akt/Akt比率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方低劑量組和中劑量組的p-Akt/Akt比率均明顯降低（P＜0.05），復(fù)方高劑量組的p-Akt/Akt比率雖有降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義性（P＞0.05），卡托普利組的p-Akt/Akt比率無(wú)明顯增減（P＞0.05）。在各治療組中，復(fù)方中劑量組的p-Akt/Akt比率最低。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt/Akt比率的影響（，n=8）

表3 化痰活血益氣方對(duì)p-Akt/Akt比率的影響（，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/mg·kg-1·d-1 p-Akt/Akt比率正常組 — 1模型組 — 1.98±0.68*復(fù)方低劑量組 4.88 0.79±0.32#復(fù)方中劑量組 9.77 0.68±0.57#復(fù)方高劑量組 19.53 1.52±0.58卡托普利組 0.02 1.98±0.44

4 討論

心肌肥厚是血流壓力負(fù)荷增加時(shí)的一種適應(yīng)性反應(yīng)[4]，然而長(zhǎng)期持續(xù)的血流壓力超負(fù)荷會(huì)使心臟失代償，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[5]。盡管給予西藥干預(yù)，由心肌肥厚所導(dǎo)致的心衰的發(fā)病率和病死率仍然居高不下[6]。中醫(yī)藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù)，抗心肌肥厚的現(xiàn)代中醫(yī)藥研究主要是以其中醫(yī)病機(jī)為依據(jù)，在相應(yīng)治法的指導(dǎo)下，針對(duì)單味中草藥及其中藥單體和中藥復(fù)方展開(kāi)的。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究單味中草藥及其中藥單體治療心肌肥厚方面取得了顯著進(jìn)展，但基于中醫(yī)病機(jī)的中藥復(fù)方研究卻鮮有聞及。這不僅不利于本病中醫(yī)認(rèn)識(shí)的發(fā)展，而且在一定程度上阻礙了中藥多組合、多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮，影響了本病的中醫(yī)臨床治療。本研究以“痰瘀互結(jié)、正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)病機(jī)理論，以二陳湯為化痰的基礎(chǔ)方，配以化痰之葶藶子、活血之丹參、補(bǔ)氣之黃芪，組建了化痰活血益氣方；該方以半夏、葶藶子化痰，為君藥；丹參活血、黃芪補(bǔ)氣、陳皮理氣化痰，三者共為臣藥；佐以茯苓健脾利濕；炙甘草調(diào)和諸藥以為使。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活是心肌肥厚發(fā)生的重要病理機(jī)制。腎小球入球小動(dòng)脈的球旁細(xì)胞分泌腎素，激活肝臟產(chǎn)生的血管緊張素原進(jìn)而生成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶作用生成AngⅡ。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應(yīng)物質(zhì)，具有收縮血管、升高血壓、促進(jìn)ALD分泌和鈉水潴留、增強(qiáng)交感神經(jīng)活性、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成等作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ參與了心肌肥厚的形成[8]。ALD可以激活交感神經(jīng)系統(tǒng)[9]，并促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[10]進(jìn)而導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原合成增加，促進(jìn)心室重構(gòu)。此外，ALD還可以增加組織對(duì)AngⅡ的結(jié)合并增強(qiáng)AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)[11]。內(nèi)皮素（endothelin，ET）是一種具有強(qiáng)大收縮血管作用的活性多肽，是調(diào)控心血管功能的重要因子，也是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的刺激物[12]。ET包括ET-1、ET-2、ET-3和血管活性腸收縮肽4種亞型，其中又以ET-1活性最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1可以通過(guò)激活MAPK和CaMKⅡ信號(hào)通路增加心肌的收縮性，并促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥厚的形成[13]。

Akt信號(hào)的異常調(diào)節(jié)在腫瘤、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病中均起著重要作用[14]，也是現(xiàn)今細(xì)胞分子機(jī)制研究的一大熱門(mén)。PI3K/Akt信號(hào)通路是病理性心肌肥厚的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。PI3K使細(xì)胞膜4，5二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化，并與Akt及其激活劑3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1結(jié)合，生成3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇，進(jìn)而導(dǎo)致Akt的磷酸化與激活[16]，活化的Akt激活相關(guān)基因的表達(dá)最終引發(fā)心肌肥厚。p-Akt/Akt比率是磷酸化的Akt與總的Akt的灰度比值，反應(yīng)的是Akt的活化程度，即總的Akt中有多少比例發(fā)生磷酸化（即活化）。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚造模成功，模型組已形成心肌肥厚。與模型組相比，復(fù)方低、中、高劑量組與卡托普利組的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均有不同程度的降低，復(fù)方中劑量組的上述各項(xiàng)指標(biāo)始終存在顯著性差異（P＜0.05）。這表明：①化痰活血益氣方可以有效改善Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚并降低神經(jīng)內(nèi)分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1含量；②在各劑量組中，等效于成人劑量的中劑量組療效最好，且該組療效優(yōu)于卡托普利組；③該復(fù)方可能通過(guò)抑制Akt信號(hào)的磷酸化來(lái)發(fā)揮其抗心肌肥厚作用。本研究以 “痰瘀互結(jié)、正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)基本病機(jī)，采用化痰活血益氣方對(duì)Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型進(jìn)行干預(yù)，以明確其抗心肌肥厚作用及對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1及Akt信號(hào)磷酸化水平的影響，以求為心肌肥厚“痰瘀互結(jié)，正氣虧虛”的中醫(yī)病機(jī)提供了細(xì)胞生物學(xué)支持，為心肌肥厚“化痰、活血、益氣”的中醫(yī)治法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為廣大臨床醫(yī)者組方治療心肌肥厚時(shí)起到拋磚引玉、投石問(wèn)路之效。