戴研平，高曉勤，秦海霞

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563006；3.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

砷是一種生殖毒物，慢性砷中毒是一個(gè)重要的全球性衛(wèi)生健康問題，研究表明中國(guó)的高砷暴露人口超過300萬(wàn)[1]。然而，目前關(guān)于砷中毒的機(jī)制研究還有待深入，尚無(wú)有效的治療藥物[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（trans forming growth factor β1,TGF-β1）是一類具有多種生物活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡等多種生命活動(dòng)[3]。TGF-β1信號(hào)通路能夠參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。TGF-β1是已經(jīng)公認(rèn)的參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移的有效調(diào)節(jié)因子[5]。人類TGF-β1信號(hào)通路元件的改變與腫瘤密切相關(guān)，TGF-β1的過度表達(dá)與人體多種腫瘤的發(fā)展和患者的預(yù)后有關(guān)[6-7]。慢性砷中毒具有致癌作用，可對(duì)人體多系統(tǒng)造成損害，影響男性生殖功能，其導(dǎo)致男性不育的病理生理機(jī)制仍值得深入研究，進(jìn)而探索有效的預(yù)防及治療方法。精子是一種具有特殊形態(tài)的細(xì)胞，頂體位于精子的前端，其內(nèi)有頂體蛋白酶，頂體蛋白酶在精子頂體反應(yīng)、精卵結(jié)合、精子穿越透明帶等過程中起重要作用。檢測(cè)精子頂體酶的活性，是判斷精液質(zhì)量、評(píng)估精子受精功能的重要指標(biāo)[8]。砷中毒是一個(gè)多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的復(fù)雜的病理過程，目前有關(guān)慢性砷中毒是否會(huì)對(duì)大鼠附睪TGF-β1及精子頂體蛋白酶活性造成影響，進(jìn)而影響男性生育力尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制慢性砷中毒的大鼠模型，研究TGF-β1在大鼠附睪的表達(dá)變化，檢測(cè)精子頂體酶活性，為慢性砷中毒導(dǎo)致男性不育的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

選擇健康清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重160～200 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，相對(duì)濕度為60%～67%，晝夜交替各 12 h。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為高（60.0 mg/L）、中（12.0 mg/L）、低（2.4 mg/L）劑量砷染毒組及對(duì)照組（蒸餾水），每組10只。測(cè)量并記錄大鼠體重和每日飲水量。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠可自由攝食、飲水，采用自由飲用方式連續(xù)染毒6個(gè)月。

1.2 主要試劑與儀器

亞砷酸鈉（分析純，北京化工廠），TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體（美國(guó) Gene Tex公司），Syn Gene Genius天才紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Image J圖像分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色二步法

采用二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：附睪組織石蠟切片用二甲苯化蠟至水，0.01 mmol/L（pH 6.0）枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)15 min，冷卻至室溫，30 ml/L過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，10 ml/L Triton-100浸泡30 min以增加細(xì)胞通透性，山羊血清37℃封閉30 min后加一抗（1∶500），4℃孵育過夜，恢復(fù)室溫30 min后滴加山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，DAB顯色3 min，蘇木精復(fù)染2 min，常規(guī)脫水、透明、封片。以上步驟間均用 0.01 mmol/L（pH 7.0～ 7.4）磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗 3 次，5 min/次。顯微鏡拍照，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值。

1.4 Western blotting

每組隨機(jī)選取3只大鼠，提取大鼠左側(cè)附睪組織勻漿，制作樣品蛋白，煮沸10 min，制作分離膠，每個(gè)孔蛋白上樣量為20 μl，室溫靜至2.5 h后電泳。轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗（TGF-β1：1∶1 000）4℃過夜，洗滌3次，10 min/次，GAPDH作為內(nèi)參。孵育二抗 2 h，洗膜 3次，10 min/次，用電化學(xué)發(fā)光液曝光成像，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

提取大鼠右側(cè)附睪組織總RNA并測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）中作為模板。TGF-β1正向引物：5'-ACTACGCCA AAGAAGTCACCC-3'，反向引物：5'-ACGCCAGGAATT GTTGCTAT-3'；GAPDH 正向引物：5'-CAAGTTCAACG GCACAGTCAA-3'，反向引物：5'-CGCCAGTAGACTCC ACGACA-3'。采用 SYBR Green I熒光染料法在 ABI 7900定量PCR儀上進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10min，95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸34s，40個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)各模板的Ct值。

1.6 精子頂體蛋白酶活性檢測(cè)

處死大鼠，每組隨機(jī)選取3只大鼠，仔細(xì)分離右側(cè)附睪尾部，待精液流出后，室溫下2000r/min（離心半徑16cm）離心2次，10min/次，PBS清洗，將沉淀物懸浮于2倍以上PBS中。取備用的PBS精子懸浮液1～2滴涂于改良明膠底物膜片上，放入37℃恒溫恒濕箱中孵育3h，檢測(cè)精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率及活性強(qiáng)度。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 頂體蛋白酶陽(yáng)性率 終止孵育后，每份切片于光學(xué)顯微鏡下均勻選取5、6個(gè)視野觀察200個(gè)精子的頭部，其周圍出現(xiàn)暈環(huán)者視為頂體蛋白酶陽(yáng)性反應(yīng)，計(jì)算精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率。

1.7.2 頂體蛋白酶活性強(qiáng)度 每個(gè)精子頭部暈環(huán)直徑的大小采用微尺測(cè)量，計(jì)算平均反應(yīng)直徑（μm），作為判斷頂體蛋白酶活性強(qiáng)度的指標(biāo)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠附睪TGF-β1灰度值及表達(dá)

TGF-β1陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于附睪上皮細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核、附睪管腔內(nèi)的精子及附睪管間質(zhì)的細(xì)胞胞質(zhì)。各組TGF-β1的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同劑量砷染毒組與對(duì)照組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組大鼠附睪TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較

各組大鼠附睪TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，不同劑量砷染毒組TGF-β1的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。見表2和圖2。

2.3 各組大鼠附睪TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的比較

各組大鼠附睪TGF-β1mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，不同劑量砷染毒組TGF-β1mRNA 表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。見表3。

表1 各組大鼠附睪TGF-β1灰度值比較（n =10，±s）

表1 各組大鼠附睪TGF-β1灰度值比較（n =10，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 灰度值對(duì)照組170.14±11.57低劑量砷染毒組119.80±0.82?中劑量砷染毒組104.75±0.40?高劑量砷染毒組84.47 ±0.35?F值 191.000 P值 0.004

圖1 TGF-β1 在大鼠附睪組織中的表達(dá) （SP ×400）

表2 各組大鼠附睪TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠附睪TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 平均光密度值對(duì)照組1.96±0.04低劑量砷染毒組1.32±0.32?中劑量砷染毒組1.03±0.03?高劑量砷染毒組0.41±0.02?F值 54.520 P值 0.018

圖2 大鼠附睪中TGF-β1蛋白表達(dá)水平

2.4 精子頂體蛋白酶活性分析

2.4.1 光學(xué)顯微鏡下觀察 對(duì)照組精子頭部暈環(huán)明顯（視為頂體蛋白酶陽(yáng)性反應(yīng)），直徑較大，數(shù)量較多。隨著砷劑量的增加，砷染毒組精子頭部孵育2h后，暈環(huán)的直徑變小，數(shù)量減少。見圖3。

表3 各組大鼠附睪TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較（n =10，±s）

表3 各組大鼠附睪TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較（n =10，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

對(duì)照組0.60±0.05低劑量砷染毒組0.43±0.03?中劑量砷染毒組0.35±0.02?高劑量砷染毒組0.29±0.02?F值 2 171.000images/BZ_16_1285_1014_2248_1085.pngimages/BZ_16_1285_1439_2248_1510.png

圖3 各組大鼠精子頂體蛋白酶陽(yáng)性反應(yīng)和活性觀察 （臺(tái)盼藍(lán)染色×400）

2.4.2 精子 ACE 活性 如表4 所示，各組頂體蛋白酶陽(yáng)性率、活性強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，低劑量砷染毒組精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率和活性強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，中、高劑量砷染毒組的精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率和活性強(qiáng)度呈逐漸下降趨勢(shì)（P＜0.05）。

表4 各組大鼠精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率和活性強(qiáng)度比較（n =10，±s）

表4 各組大鼠精子頂體蛋白酶陽(yáng)性率和活性強(qiáng)度比較（n =10，±s）

注 ：①與對(duì)照組比較，P ＞0.05；②與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 陽(yáng)性率/% 活性強(qiáng)度/μm對(duì)照組92.5±11.5 50.3±23.1低劑量砷染毒組83.3±10.6① 37.4±19.3①中劑量砷染毒組40.0±9.2② 16.8±13.7②高劑量砷染毒組20.4±6.4② 8.9±2.5②F值 760.000 27.760 P值 0.001 0.002

3 討論

砷是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可顯著影響睪酮和雌激素，導(dǎo)致代謝紊亂和生殖障礙[9]。研究表明砷化物對(duì)細(xì)胞的影響因劑量不同而有所不同[10]。研究發(fā)現(xiàn)，砷超過一定劑量時(shí)對(duì)男性性功能造成嚴(yán)重影響。砷能在附睪產(chǎn)生蓄積，損害雄性生殖細(xì)胞[11]。

TGF-β1是TGF-β家族的主要亞型，在局部炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起非常重要的作用。TGF-β1作為一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的多肽，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、免疫功能等密切相關(guān)[12]。抑制TGF-β1的表達(dá)可以在一定程度控制疾病的發(fā)展，因此TGF-β1已經(jīng)成為臨床疾病治療研究的重要靶點(diǎn)[13]。

細(xì)胞凋亡在病理情況下可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是一個(gè)由多基因參與的細(xì)胞死亡過程。本課題組前期研究結(jié)果表明，慢性砷中毒能夠引起大鼠附睪上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響男性生殖功能[14]。而國(guó)外學(xué)者報(bào)道TGF-β1在腫瘤早期發(fā)揮抗凋亡的作用[3]，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示TGF-β1可能作為一種保護(hù)因子參與慢性砷中毒機(jī)制。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果示TGF-β1表達(dá)于附睪上皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核及部分精子。與對(duì)照組比較，不同劑量砷染毒組TGF-β1的免疫組織化學(xué)表達(dá)強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。Western blotting、qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同劑量砷染毒組TGF-β1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均較低。以上結(jié)果說(shuō)明砷可能通過影響大鼠附睪TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)附睪上皮細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育產(chǎn)生影響，導(dǎo)致病理狀態(tài)下的凋亡細(xì)胞增加，影響附睪微環(huán)境的形成和精子的成熟，最終影響男性生育力。

附睪是精子成熟的場(chǎng)所，精子必須在附睪中才能獲得功能上的成熟。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，砷能夠?qū)Υ笫蟾讲G中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體c-met、凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)與透明質(zhì)酸酶活性造成影響，可能與男性不育有關(guān)[15-16]。精子頂體蛋白酶和透明質(zhì)酸酶都是受精過程中的關(guān)鍵酶，頂體蛋白酶能夠水解透明帶，頂體蛋白酶的陽(yáng)性率和活性降低是導(dǎo)致男性不育的重要因素[17-18]。本實(shí)驗(yàn)采用本課題組已經(jīng)成熟的固定明膠底膜法檢測(cè)慢性砷中毒對(duì)頂體蛋白酶活性的影響[19-20]，發(fā)現(xiàn)中、高劑量砷染毒組精子頂體蛋白酶活性和陽(yáng)性率較對(duì)照組下降，其原因可能為精子含有大量的高爾基復(fù)合體和大量線粒體，線粒體作為細(xì)胞的供能器，其可能是砷發(fā)揮毒性作用的亞細(xì)胞器，而線粒體的變化又從多方面引起細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說(shuō)明慢性砷染毒可能通過影響附睪因子TGF-β1的表達(dá)和附睪微環(huán)境的形成，進(jìn)而影響精子頂體的完整性，導(dǎo)致精子頂體蛋白酶的流失，最終影響精子受精能力下降，引起男性不育。

綜上所述，砷能夠?qū)δ行陨诚到y(tǒng)造成損害。TGF-β1表達(dá)的異?？赡軙?huì)對(duì)附睪微環(huán)境及精子的頂體蛋白酶產(chǎn)生影響，可能與砷中毒導(dǎo)致男性不育的病理機(jī)制密切相關(guān)。