郭慧娟, 賈舉慶, 李 欣, 喬麟軼, 閻曉濤, 任永康, 常利芳, 張樹偉, 暢志堅, 張曉軍

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 山西省主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點科技創(chuàng)新平臺，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminisf. sp. Tritici(Bgt))侵染小麥葉片，從而引起小麥產(chǎn)量與品質(zhì)嚴重降低的一種重大病害，其發(fā)病范圍遍布世界所有小麥種植區(qū)，在潮濕冷涼地區(qū)尤為嚴重[1]。充分挖掘與利用小麥本身的抗病基因，選育與推廣抗病品種是抵抗病害的一種經(jīng)濟環(huán)保的有效手段[2]。但在小麥育種中常常使用品種間雜交，使新育成的品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗源單一，缺乏對病害持久的抗性，其抗性會隨著白粉菌生理小種的變異而很快喪失，造成病害的迅速擴展流行，嚴重制約著小麥的安全生產(chǎn)[3]。因此，從小麥野生種及近緣種中挖掘并導入新的抗病基因，增強栽培品種對病害的抵抗能力可以延緩病菌生理小種的變異，從而有效控制并降低小麥白粉病大范圍的發(fā)生[4]。

迄今為止，國內(nèi)外學者已在小麥的70余個位點上鑒定出100多個抗白粉病基因或QTLs[5]，這些抗病基因分別來源于栽培小麥、野生小麥以及小麥的近緣物種。除與小麥親緣關(guān)系較近的野生和栽培一粒小麥、二粒小麥、波斯小麥、硬粒小麥以及烏拉爾圖小麥和粗山羊草外[6-8]，現(xiàn)代育種研究中已有多個野生近緣物種成功用于小麥遺傳改良，如山羊草、冰草、新麥草、黑麥、偃麥草、鵝冠草、簇毛麥、大賴草等[9]。其中，偃麥草屬中的中間偃麥草因抗病、抗逆、抗蟲、多花、優(yōu)質(zhì)及容易與小麥雜交等優(yōu)點，被國內(nèi)外學者廣泛應(yīng)用，已成為小麥近緣植物中不可多得的優(yōu)良基因源[10]。

CH7015是利用普通小麥與八倍體小偃麥進行遠緣雜交培育的小麥新種質(zhì)，在苗期與成株期均免疫白粉病，且具有矮稈直立、株型緊湊、結(jié)實率高、籽粒飽滿等優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是一個高抗白粉病的優(yōu)異種質(zhì)資源。本研究擬利用SSR標記和BSA(分離群組分析法)方法對感病材料臺長29和CH7015構(gòu)建的F1、F2、F2:3群體進行遺傳分析，以明確CH7015中抗白粉病基因的數(shù)目及遺傳方式，并對其抗病基因進行染色體定位，旨在為該基因的克隆及其更有效地利用于抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

遺傳分析及作圖群體為CH7015與高感白粉病品種臺長29構(gòu)建的F1、F2、F2∶3及BC1；CH7015是以普通小麥晉太170與八倍體小偃麥TAI8335雜交后回交1次，再經(jīng)系譜法選育的高代品系；臺長29為普通小麥品種，高感小麥白粉病。

CH7015、晉太170、TAI8335、臺長29均來自山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所；感病品種SY95-71[11]來自四川農(nóng)業(yè)大學，用于活體繁殖白粉菌種及感病對照；白粉菌生理小種E09來自中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，用于遺傳群體及親本材料的苗期抗病鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗病性鑒定 苗期抗病性鑒定在人工氣候室內(nèi)進行。鑒定材料分別為：臺長29、CH7015，臺長29 × CH7015的F1、F2、BC1和F2∶3家系，以及CH7015的親本TAI8335和晉太170。

將試驗材料播種在12穴 × 6穴的育苗盤內(nèi)，每個材料播種10粒，感病對照SY95-71播種于育苗盤的四角以及中間一排，共設(shè)3次重復。人工氣候室內(nèi)設(shè)置為：光照周期12 h/d，光照強度為6 000 lux，溫度為有光21 ℃、無光16 ℃，相對濕度控制在75%左右。播種后保持土壤濕潤，約10 d后，鑒定材料的第1片葉片完全展開時，用帶有新鮮白粉菌孢子的活體麥苗均勻掃抹待鑒定材料，第2天再重復接種1次，保證充分接菌。繼續(xù)培養(yǎng)12～15 d，當感病對照充分發(fā)病時，對材料的抗病性進行調(diào)查。根據(jù)葉片反應(yīng)類型及白粉菌孢子生長情況記載材料的抗病性，參照盛寶欽[12]描述的記載標準，具體分為免疫(IF=0)，近免疫(IF=0;)，高抗(IF=1)，中抗(IF=2)，中感(IF=3)，高感(IF=4)6個級別，其中，0～2級屬于抗病型，3～4級屬于感病型。

鑒定結(jié)果使用Microsoft Excel 2013進行整理匯總，使用SPSS 18.0計算抗、感分離比例，并進行χ2分離比適合度測驗，最終推斷CH7015中含有的抗白粉病基因數(shù)目和類型。

1.2.2 DNA的提取及抗感病池的建立 分別取臺長29、CH7015及其F1、F2的幼嫩單株葉片，在液氮中冷凍后，在2.0 mL離心管中使用寧波新芝Scientz-48型高通量組織研磨器將葉片打成粉末狀，采用SDS法提取基因組DNA[13]。

根據(jù)F2及F2∶3家系抗感病調(diào)查結(jié)果，選取10株純合抗病植株(F2表型為0級和0;級，且其F2∶3家系植株全部為抗病)，分別取其等量DNA混合建立抗病池；選取10株純合感病植株(F2表型為4級且其F2∶3家系植株全部為感病)，分別取其等量DNA混合建立感病池。

1.2.3 SSR引物及PCR擴增 用于群體篩選的分子標記來源于小麥基因數(shù)據(jù)庫3.0(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)網(wǎng)站。選取分布于小麥21對染色體上的825對SSR引物，委托北京華大基因公司合成，加滅菌蒸餾水溶解后置于冰箱中-20 ℃保存。

使用MJ Research公司生產(chǎn)的PTC-200型PCR儀進行擴增，反應(yīng)體系為15 μL：滅菌水7.45 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL，1.5 mmol/μL引物1.8 μL，1 mmol/μL dNTP Mix 2 μL，5 U/μLTaq酶 0.75 μL，200 mmol/μL模板DNA 1.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，退火45 s，退火溫度58 ℃左右(根據(jù)引物進行適當調(diào)整)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

擴增產(chǎn)物加入5 μL Loading Buffer作為指示劑，混勻后使用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離[14]，恒壓200 V，電泳時間60 min，銀染顯色照相后統(tǒng)計帶型。

1.2.4 連鎖分析及染色體定位 使用825對SSR引物在CH7015和臺長29間進行PCR擴增，篩選有親本間具有多態(tài)性的引物。利用篩選到的引物在抗病池和感病池間進行擴增，繼續(xù)篩選在抗、感病池間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物。將篩選出的多態(tài)性引物利用由10株純合抗和10株純合感的單株組成的小群體進行驗證。在抗親、抗池、抗病小群體都表現(xiàn)一致，且在感親、感池、感病小群體也都表現(xiàn)一致的標記初步推斷為抗病基因的連鎖標記。將篩選出的引物對臺長29×CH7015的全部F2單株DNA擴增，進行抗病基因連鎖分析。獲得的連鎖標記使用中國春缺體-四體和雙端體系進行染色體定位，以確定目標基因所在染色體位置。

用Mapmaker Exp 3.0[15-16]軟件進行連鎖分析，并計算SSR連鎖標記與抗病基因的遺傳距離，用MapDraw v2.1繪制遺傳連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期鑒定結(jié)果與抗性遺傳分析

利用白粉菌菌株E09對CH7015及其親本TAI8335、晉太170進行苗期接種鑒定，結(jié)果表明，CH7015和TAI8335表現(xiàn)為免疫或近免疫(IT=0或0;)，晉太170和感病對照SY95-71表現(xiàn)為高感白粉病(IT=4)。CH7015來源于組合“晉太170×2/TAI8335”的高代選系，TAI8335為利用普通小麥晉春5號和太原768與中間偃麥草雜交選育的八倍體小偃麥，由于TAI8335的小麥親本晉春5號和太原768都高感白粉病[17]，中間偃麥草則免疫白粉病，所以，CH7015的小麥親本中都不含抗白粉病基因，其對白粉菌株E09的抗性可能來源于TAI8335或中間偃麥草。

利用白粉菌菌株E09對CH7015、臺長29及其正反交F1、BC1群體進行苗期接種鑒定，結(jié)果如表1所示，CH7015和正反交F1所有植株均表現(xiàn)為免疫或近免疫(IT=0或0;)，臺長29表現(xiàn)為高感(IT=4)，其F1全部表現(xiàn)為與CH7015相同的抗病反應(yīng)，以臺長29為回交親本的BC1群體則呈現(xiàn)1∶1的分離比例。說明CH7015對白粉菌株E09的抗性由顯性基因控制。

臺長29 × CH7015的F2群體抗性鑒定結(jié)果表明，在388個鑒定植株中，有296個植株表現(xiàn)為抗病(IT=0～2)，92個植株表現(xiàn)為感病(IT=3～4)，χ2檢驗抗感分離比例符合3∶1的理論值(χ2= 0.17，P=0.68)。BC1回交群體中抗病單株為23個，感病單株為23個，卡方檢驗抗感分離比例符合1∶1的理論值(χ2=0.01，P=0.91)。

表1 CH7015、臺長29及其遺傳群體對白粉菌株E09的抗性反應(yīng)Tab.1 Resistance reaction to bgt E09 of CH7015, Taichang 29 and their generation groups

綜上分析認為，小麥新種質(zhì)CH7015中的抗白粉病基因PmCH7015為1個顯性核基因，其遺傳方式符合孟德爾分離規(guī)律。

2.2 CH7015中抗白粉病基因的SSR標記分析

抗、感親本篩選結(jié)果表明，在825對SSR引物中，共有326對在CH7015和臺長29之間表現(xiàn)出多態(tài)性。進一步利用這326對引物在抗、感病池間進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Xwmc68、Xgpw2328、Xgpw7272、Xwmc657、Xgpw4079等5對引物能在抗、感病池間表現(xiàn)出多態(tài)性，且多態(tài)性條帶與其抗、感親本一致。使用抗、感小群體進行驗證后發(fā)現(xiàn)，它們可以在抗病小群體和抗病親本之間與感病小群體和感病親本之間分別擴增出相同的特異條帶(圖1)。因此，推斷這5個標記與抗病基因PmCH7015連鎖。

利用上述5個標記檢測F2群體的388個單株DNA，結(jié)合F2和F2∶3群體的表現(xiàn)型分析，證實這5個標記均與抗病基因PmCH7015連鎖。

M.Marker；PR.CH7015；PS.臺長29；BR.抗病池；BS.感病池；R.純合抗病株；S.純合感病株；箭頭指示特異擴增條帶。 M.Marker；PR.CH7015；PS.Taichang 29；BR.Resistant bulk；BS.Susceptible bulk；R.Homozygous resistant plant； S.Homozygous susceptible plant; Arrows indicated the specifc bands.

M.Marker； PR.CH7015；PS.臺長29；CS.中國春；N4B-T4A，N4A-T4B，N4D-T4A.中國春缺體-四體N4BT4A，N4AT4B，N4DT4A；Dt4BS.中國春雙端體Dt4BS。

M.Marker； PR.CH7015；PS.Taichang 29；CS.Chinese Spring；N4B-T4A，N4A-T4B，N4D-T4A.Nullisomic-tetrasomic lines；Dt4BS.Ditelosomoc Dt4BS.

圖2Xwmc68和Xwmc657的染色體定位及抗白粉病基因PmCH7015的遺傳連鎖圖譜
Fig.2 Chromosome location of SSR markersXwmc68andXwmc657in genetic linkage map ofPmCH7015

2.3 抗白粉病基因PmCH7015的染色體定位及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

根據(jù)在Graingenes小麥基因數(shù)據(jù)庫中查詢5對連鎖標記信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有Xgpw2328同時位于4B、4D、5A染色體上，其余4個標記均被定位于Xgpw4079、Xwmc657、Xwmc68和Xgpw7272小麥4B染色體上。因此初步推斷，PmCH7015位于4B染色體上。利用中國春缺體-四體和Dt4BS雙端體系進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Xwmc68、Xwmc657可以在N4A-T4B、N4D-T4A和Dt4BS上擴增出預(yù)期條帶，但在N4B-T4A上卻擴增不出該目標條帶，證明PmCH7015的連鎖標記位于小麥4BS染色體上。

利用Mapmaker Exp 3.0計算遺傳距離和MapDraw v2.1繪制遺傳連鎖圖譜，結(jié)果顯示，PmCH7015及其連鎖標記的位置順序為：Xwmc657、Xgpw2328、Xwmc68、PmCH7015、Xgpw4079和Xgpw7272，其遺傳距離如圖2所示，PmCH7015兩側(cè)連鎖標記Xgpw4079和Xwmc68的遺傳距離分別為1.4,8.2 cM。

3 討論

中間偃麥草是小麥遺傳改良中重要的野生近緣種，1950年以來，已將中間偃麥草的抗條紋花葉病、黃矮病、條銹病和白粉病等多種抗性導入普通小麥中[17-20]，選育出了TAF46、中1、中2、中4、TE253等多個八倍體小偃麥。Chang等[21]利用中間偃麥草選育的八倍體小偃麥TAI8335兼抗白粉、條銹、葉銹等多種小麥主要病害。CH7015是以普通小麥晉太170與TAI8335雜交后回交一次，再經(jīng)系譜法選育的高代品系。TAI8335的小麥親本晉春5號、太原768和CH7015的小麥親本晉太170均高感白粉病，而TAI8335與其野生親本中間偃麥草則對白粉病表現(xiàn)為免疫。因此，初步推測PmCH7015來源于中間偃麥草。

國內(nèi)外鑒定出的100多個正式命名的抗白粉病基因或QTLs中，只有定位于小麥7BS上的Pm40和2DL上的Pm43來源于中間偃麥草[22-23]，還有一些來源于中間偃麥草尚未正式命名的抗白粉病基因，如位于7BS上的PmE、2DL上的PmYU25、2BS上的PmL962和4BL上的PmCH83等[24-27]，這些抗病基因分別來源于中間偃麥草的J及JS染色體組。在PmCH7015的親本TAI8335中含有1對S組、3對JS組、1對J組及2對J/S易位染色體，因此，尚無法推測PmCH7015來源于哪一個染色體組，這需要進一步尋找更多的證據(jù)才有可能獲得最終結(jié)論。

本研究最終篩選出5個SSR標記，Xwmc657、Xgpw2328、Xwmc68、Xgpw4079和Xgpw7272，將PmCH7015定位在小麥4BS染色體上。在小麥的21條染色體中，除4D染色體外，其他染色體上均有抗白粉病基因分布，但在4B染色體上只有源于黑麥的Pm7位于4BL上[28]，4BS上并無小麥抗白粉病基因的報道。因此，PmCH7015是一個新發(fā)現(xiàn)的抗白粉病基因位點。

種質(zhì)資源的挖掘與利用是作物育種創(chuàng)新突破的重要前提。在已發(fā)現(xiàn)的抗白粉病基因中，Pm4、Pm8等雖然在小麥生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[29]，但隨著白粉菌小種的變異，這些抗病基因絕大多數(shù)已喪失抗性，僅憑現(xiàn)有的少數(shù)抗病基因很難實現(xiàn)抗源多樣化，因此，仍需發(fā)掘新的抗病基因資源。CH7015是利用普通小麥與八倍體小偃麥進行遠緣雜交培育的小麥新種質(zhì)，在苗期與成株期均免疫白粉病，且具有矮稈直立、株型緊湊、結(jié)實率高、籽粒飽滿等優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是一個高抗白粉病的優(yōu)異種質(zhì)資源，可用于小麥白粉病抗性改良。與抗病基因PmCH7015連鎖的分子標記，亦可為抗病基因圖位克隆與分子育種提供技術(shù)支撐。