韓麗珍,2， 劉 暢， 鄧兆輝， 朱春艷

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rizobacteria, PGPR)是指以定殖或自由附著的方式生活在植物根際的一類細(xì)菌總稱[1]。它能改變根際土壤的理化性質(zhì)、提高根際土壤中對植物生長有利的營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化[2]，也可通過分泌鐵載體、有機(jī)酸、生物表面活性劑、植物生長激素等，直接或間接促進(jìn)植物的生長[3]。不同植物根際分離到的促生菌菌株對相應(yīng)植物的種子萌發(fā)可能具有一定的促進(jìn)作用。從柳枝稷根莖中分離篩選到可分泌IAA的Pseudomonas和Rhizobium細(xì)菌菌株，接種后可以提高鹽脅迫下柳枝稷種子的發(fā)芽率，促進(jìn)胚根和胚芽的生長[4]。從西藏黑青稞根際篩選到的4株菌株對青稞種子發(fā)芽促進(jìn)作用顯著，但不同菌株影響有差異[5]。而從大豆種子中分離到的內(nèi)生芽孢桿菌菌株，大部分均表現(xiàn)出促進(jìn)大豆發(fā)芽的作用，其中促生作用最好的SN 10 E 1菌株為巨大芽孢桿菌[6]。也有報(bào)道表明促生作用并不僅僅局限在同種屬的植物中。李青梅等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑處理的黃瓜、番茄、茄子及辣椒等4種蔬菜種子的發(fā)芽率均高于對照，但對蔬菜幼苗根生長的影響因蔬菜種類不同而異[7]。而從油菜根際土壤中分離到的3株菌N-1、N-15、K-25可使桔梗種子的發(fā)芽率和幼苗莖長明顯高于對照，也證明從一種植物根際能分離到對另一種植物有促生作用的功能菌，促生菌在不同植物根際的分布和作用存在交叉現(xiàn)象[8]。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室從茶樹根際分離篩選到4株細(xì)菌菌株，其中PseudomonashunanensisGD 3具有溶磷解鉀能力，AgrobacteriumradiobacterKKS-6-N 1菌株具有固氮能力，2個(gè)菌株對白菜、空心菜及莧菜具有促生作用[9-10]。P 5菌株是采集茶樹根際土壤、以阿須貝無氮培養(yǎng)基篩選獲得的1株細(xì)菌，具有一定的固氮效能，而其余的促生特性還未知。本研究擬通過P 5菌株與2株具優(yōu)良促生性能的GD 3和KKS-6-N 1進(jìn)行浸種試驗(yàn)，比較不同菌株對辣椒和花生種子萌發(fā)的影響；并通過灌根處理盆栽花生幼苗，研究P 5菌株對花生根際土壤微生物功能的影響效應(yīng)，從根本上解析P 5菌株的促生機(jī)制。

1 材 料

1.1 供試菌株及材料

3株茶樹根際細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5(未知種屬)均為本實(shí)驗(yàn)室從不同環(huán)境茶樹根際土壤中分離獲得，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試材料與土壤

供試花生及辣椒種子均為當(dāng)?shù)厥惺鄯N子。土壤來源于貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)農(nóng)田土壤(26°42′48″N，106°67′31″E)，去除表面枯枝浮土后，采集距表面20～50 cm處土壤，過篩后用于盆栽試驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基及馬丁培養(yǎng)基按《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[11]，參考Mab等[12]的方法配制蛋白胨氨化培養(yǎng)基、吳翔等[13]的方法配制阿須貝氏無氮培養(yǎng)基，NBRIP培養(yǎng)基參考Nautiyal等[14]的方法，亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基參考何琳燕等[15]的方法。

2 方 法

2.1 菌種的活化及菌液的制備

將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的GD 3、KKS-6-N 1和P 5菌液取出適量，接種于LB培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫?fù)u床中，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜活化；翌日取活化的菌液再次轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)24 h，菌液測定OD600值，以無菌LB調(diào)整該值為1.0備用。

2.2 菌株浸種處理對辣椒種子萌發(fā)及盆栽試驗(yàn)的影響

將辣椒種子置于3%次氯酸鈉溶液中進(jìn)行表面消毒10 min，用蒸餾水反復(fù)清洗多次后，處理組的辣椒種子分別置于OD600值為1.0的3種菌液中浸種2 h，未處理組對照種子則置于LB培養(yǎng)基中；浸種完成后用無菌濾紙略微蘸干表面液體、置于鋪有被無菌水潤濕的無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置15 d，期間保持濾紙濕潤，統(tǒng)計(jì)辣椒種子的發(fā)芽率；之后移栽于裝有300 g土壤的育苗盆中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，整個(gè)試驗(yàn)期間保持土壤濕潤，30 d后收獲測定植株生長指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)對照組、GD 3處理組、KKS-6-N 1處理組和P 5處理組，每組為25粒種子，重復(fù)3次；盆栽試驗(yàn)時(shí)每組6株幼苗，重復(fù)3次。

2.3 菌株浸種處理對花生種子萌發(fā)的影響

將花生種子置于20%過氧化氫溶液中進(jìn)行表面消毒20 min，經(jīng)蒸餾水反復(fù)清洗后浸泡6～12 h，以無菌濾紙略微蘸干后置于3種菌株的菌液中進(jìn)行2 h浸種處理，對照種子則置于LB培養(yǎng)基中；待浸種完成后，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置3 d，統(tǒng)計(jì)花生種子的發(fā)芽率。種子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理同上。

表1 3株茶樹根際細(xì)菌浸種對辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

生長性狀ckGD3KKS-6-N1P5發(fā)芽率/%70.67±5.00b92.00±6.53a89.33±3.77a92.00±3.27a鮮重/g0.11±0.01b0.17±0.00a0.18±0.02a0.16±0.03a株高/cm2.22±0.19b4.11±0.55a3.89±0.29a4.10±0.21a根長/cm4.10±0.40c6.95±0.53b4.64±0.18c9.42±0.79a

注：同一行不同小寫字母代表不同處理之間差異顯著(p<0.05)。下同。

2.4 菌株灌根處理對花生幼苗生長的影響

將花生種子經(jīng)過氧化氫消毒，蒸餾水清洗浸泡后，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，30 ℃條件下3 d待種子萌發(fā)后，選擇長勢相當(dāng)?shù)幕ㄉ酌缫圃杂谟缗柚?，以未接種菌株為對照，設(shè)置GD 3接種組、KKS-6-N 1接種組和P 5接種組，每2 d采用灌根法接種菌液，接種量為每次5 mL，對照組則用等量無菌LB培養(yǎng)基代替，每組均設(shè)6個(gè)重復(fù)，常規(guī)方式管理。30 d后測定花生株高、鮮重、根重及葉綠素含量等生長及生理指標(biāo)，葉綠素含量采用Arnon法測定。

2.5 P 5菌株灌根對花生營養(yǎng)指標(biāo)的影響

盆栽實(shí)驗(yàn)30 d后，測定P 5接種組及對照組花生植株的營養(yǎng)指標(biāo)，植株全氮含量測定采用凱氏定氮法，全磷含量測定采用鉬銻抗比色法，全鉀含量測定采用火焰分光光度法[16]進(jìn)行。

2.6 P 5菌株灌根對花生根際土壤三大菌群及功能菌群的影響

30 d盆栽實(shí)驗(yàn)后，利用抖根法收集P 5處理組的花生根際土壤，測定土壤三大菌群(細(xì)菌總數(shù)、放線菌總數(shù)及真菌總數(shù))，功能菌群數(shù)量的測定包括氨化細(xì)菌、固氮菌、溶磷菌及解鉀菌等4種類型。細(xì)菌、放線菌及真菌總數(shù)分別以LB固體培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基及馬丁培養(yǎng)基測定，采用稀釋平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)；以蛋白胨氨化培養(yǎng)基培養(yǎng)氨化細(xì)菌，采用最大近似值法(MPN, most probable numbers)測定；固氮菌、溶磷菌及解鉀菌分別以阿須貝無氮培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基及亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，以稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)。

2.7 P 5菌株灌根對花生根際土壤酶活性的影響

采集P 5灌根處理30 d的花生根際土壤進(jìn)行土壤酶活性測定。土壤蔗糖酶酶活的測定采用硫代硫酸鈉滴定法，單位酶活是指每克干土所消耗的硫代硫酸鈉(0.05 mol·L-1)體積(mL·g-1)[17]；過氧化氫酶酶活采用高錳酸鉀滴定法，單位酶活是指每克干土于20 min內(nèi)所消耗的高錳酸鉀(0.1 mol·L-1)體積(mL·g-1)；脲酶酶活的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，單位酶活是指37 ℃條件下、24 h處理后每克風(fēng)干土壤中的氨氮含量(mg·g-1)[18]；中性磷酸酶酶活是指每克干土經(jīng)24 h處理后釋放酚的體積(mg·g-1)，參照吳金水等[19]的方法進(jìn)行測定。

2.8 P 5菌株的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

P 5菌株的初步鑒定采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行。利用細(xì)菌DNA提取試劑盒抽提菌株的DNA，以細(xì)菌16 S rRNA基因的通用引物對27 F/1492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上、下游引物序列分別為27 F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，1492 R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[20]。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件參考王歡等[10]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測到有既定大小的條帶(約1 500 bp)送至上海英駿生物工程公司測序。獲得的核苷酸序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站上BLAST進(jìn)行在線同源性比較，選擇相似性最高的結(jié)果進(jìn)行分析。選取克雷伯氏菌屬的不同種菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以PseudomonasmooreiRW 10 T(AM 293566)作外群。采用Clustal W 2進(jìn)行多重序列比對、Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)[21]。

2.9 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 20.0軟件，以LSR多重比較對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 3株茶樹根際細(xì)菌浸種對辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

利用從茶樹根際分離、篩選到的3株細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1及P 5對辣椒進(jìn)行浸種試驗(yàn)，萌發(fā)后于盆栽條件下繼續(xù)生長30 d后測定幼苗的相應(yīng)生長指標(biāo)。以3株細(xì)菌菌液進(jìn)行了2 h的浸種處理后，辣椒種子的萌發(fā)率均在90%左右，較對照顯著提高了近20%，但不同菌株處理之間并無顯著性差異(p<0.05)。30 d的盆栽實(shí)驗(yàn)表明，與對照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5浸種處理的辣椒幼苗鮮重分別增加54.55%、63.64%和45.46%，株高分別增長85.14%、75.23%和84.69%，根長分別增長了69.51%、13.17%和129.76%。顯然，3株茶樹根際細(xì)菌的浸種處理使辣椒種子的發(fā)芽率明顯提高，且對辣椒的株高和鮮重具有顯著促生作用；其中，P 5浸種處理的植株根長明顯高于對照及其余2個(gè)菌株的處理。

3.2 3株茶樹根際細(xì)菌浸種對花生種子萌發(fā)的影響

利用3株茶樹根際細(xì)菌菌株對花生進(jìn)行相同的浸種處理，3 d后統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌劑浸種處理組的發(fā)芽率均在90%以上，較對照種子的發(fā)芽率提高了20%以上，3株細(xì)菌菌株對種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)效果，但不同菌株處理之間對種子萌發(fā)率并無顯著差異(圖1)。

圖1 3株茶樹根際細(xì)菌對花生種子萌發(fā)的影響

3.3 3株茶樹根際細(xì)菌灌根處理對花生幼苗生長的影響

為了進(jìn)一步探討根際細(xì)菌對花生幼苗生長的影響作用及內(nèi)在機(jī)制，分別利用3株菌液進(jìn)行灌根處理，培育30 d后測定花生的生長性狀(表2)，發(fā)現(xiàn)3株菌株對花生幼苗生長的影響呈現(xiàn)一定差異。與對照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5灌根處理的花生幼苗鮮重分別增長4.63%、26.83%和35.12%，株高分別增加了5.99%、16.22%和32.73%，根重分別增長21.62%、29.73%和35.14%。生理指標(biāo)的測定結(jié)果顯示，GD 3和KKS-6-N 1接種組的葉綠素含量略低于對照，而P 5接種組的葉綠素含量較對照提高了13.47%。結(jié)果(圖2)表明，P 5菌株的灌根處理對花生幼苗的促生效果顯著，其次為KKS-6-N 1。

表2 3株茶樹根際細(xì)菌對花生幼苗生長的影響

生長性狀ckGD3KKS-6-N1P5鮮重/g4.10±0.25c4.29±0.43c5.20±0.40b5.54±0.21a株高/cm36.57±0.67c38.76±0.53bc42.50±2.62b48.54±0.72a根重/g0.37±0.11c0.45±0.11b0.48±0.11ab0.50±0.05a葉綠素含量/(mg·g-1)4.90±0.16b4.79±0.02c4.62±0.35c5.56±0.62a

3.4 P 5菌株灌根處理對花生植株?duì)I養(yǎng)元素的影響

由于P 5菌株可以顯著促進(jìn)花生幼苗鮮重和株高的增加，因而經(jīng)P 5灌根處理的花生植株進(jìn)行了營養(yǎng)指標(biāo)測定(表3)，發(fā)現(xiàn)接種組植株的全氮增高了13.56%，與對照呈現(xiàn)顯著差異；全鉀含量略有提升，但差異不明顯，而全磷含量基本無改變(p<0.05)。

注：圖左3株花生為P 5菌株處理，圖右3株為ck。圖2 根際促生菌菌株P(guān) 5對花生幼苗生長的影響

表3 根際促生菌菌株P(guān) 5對花生植株?duì)I養(yǎng)元素的影響

營養(yǎng)元素ckP5全氮/%2.36±0.16b2.68±0.19a全磷/%0.11±0.02a0.12±0.04a全鉀/%1.92±0.10a2.03±0.02a

3.5 P 5菌株灌根處理對花生根際土壤三大菌群和功能菌群數(shù)量的影響

由于土壤微生物在土壤營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)及維持土壤肥力方面起著重要作用，實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步從土壤菌群數(shù)量和土壤酶活入手，解析該菌株對花生的促生機(jī)制。對P 5菌株灌根處理的花生根際土壤及對照土壤進(jìn)行三大菌群總數(shù)的測定(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組根際土壤中的細(xì)菌總數(shù)較對照增長了2.63倍，真菌總數(shù)增長了2倍，細(xì)菌數(shù)/真菌數(shù)之比增加了1.32倍，菌劑處理使得細(xì)菌和真菌數(shù)量較對照呈現(xiàn)顯著差異，而放線菌總數(shù)并無明顯差異(p<0.05)。由于P 5處理后的花生根際土壤中細(xì)菌總數(shù)顯著提高，因而對根際土壤中與促生相關(guān)的功能菌群數(shù)量進(jìn)行了測定(表4)，發(fā)現(xiàn)氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)分別較對照增高了2倍和2.44倍，溶磷菌數(shù)增高了4.07倍，與土壤氮磷含量直接相關(guān)的氨化細(xì)菌、固氮菌及溶磷菌數(shù)均明顯高于對照，而解鉀菌數(shù)略有下降，但差異不顯著(p<0.05)。

3.6 P 5菌株灌根處理對花生根際土壤酶活性的影響

酶活性的測定結(jié)果(表5)顯示，與對照相比，處理組根際土壤的蔗糖酶活性增加了1.41倍，過氧化氫酶活性增長了2.65倍，脲酶增長了2.33倍，中性磷酸酶活性基本無改變，表明P 5浸種處理的花生根際土壤中，蔗糖酶、過氧化氫酶及脲酶酶活性均較對照有顯著提高(p<0.05)。

表6 P 5菌株的16 S rRNA基因相似性比對

種菌株GenBank登錄號相似性/%Klebsiella variicolaA6128KM27566699.93Klebsiella pneumoniaeNKU_Kleb8A7CP04164499.86Klebsiella variicolaDX120ECP00927499.86Klebsiella variicolaAt-22CP00189199.86Klebsiella variicola342CP00096499.86

圖3 P 5菌株的16 S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 根際促生菌菌株P(guān) 5對花生根際土壤三大菌群數(shù)量(cfu·g-1)的影響

處理ckP5細(xì)菌總數(shù)(×107)2.63±0.98b6.93±1.10a放線菌總數(shù)(×105)9.33±0.51a8.53±0.53a真菌總數(shù)(×103)3.92±0.40b7.84±0.50a氨化細(xì)菌數(shù)(×105)6.33±0.13b12.67±2.03a固氮菌數(shù)(×105)3.83±0.62b9.34±0.24a溶磷菌數(shù)(×105)4.74±0.53b19.30±0.35a解鉀菌數(shù)(×105)6.72±0.51a5.26±0.64a

表5 根際促生菌菌株P(guān) 5對花生根際土壤酶活性的影響

處理ckP5蔗糖酶/(mL·g-1)4.40±0.39b6.21±0.53a過氧化氫酶/(mL·g-1)5.63±2.30b14.93±1.51a脲酶/(mg·g-1)0.03±0.02b0.07±0.00a中性磷酸酶/[μg·(g·h)-1]1.76±0.71a1.71±0.35a

3.7 P 5菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用細(xì)菌16 S rRNA基因的通用引物對27 F/1492 R對P 5細(xì)菌的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果獲得1 405 bp的核苷酸序列，經(jīng)NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與其一致性最高的菌株為克雷伯氏菌屬、變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，與該種A 6128菌株的16 S rRNA基因相似性為99.93%，此外與多株變棲克雷伯氏菌菌株及肺炎克雷伯氏菌 NKU_Kleb 8 A 7菌株的相似性均為99.86%(表6)。與同屬內(nèi)的不同種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，可見P 5菌株與Klebsiellavariicola的不同菌株聚于一大枝，且與該種DX 120 E菌株(CP 009274)的16 S rRNA基因在系統(tǒng)樹上相鄰，因而結(jié)合分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹，可將P 5菌株鑒定為Klebsiellasp.。

4 結(jié)論與討論

本研究中使用的3株細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5均是從茶樹根際分離篩選獲得的，浸種試驗(yàn)表明，3株細(xì)菌均可使辣椒及花生種子的發(fā)芽率達(dá)到90%以上，較對照相比，發(fā)芽率可提高20%左右，對辣椒及花生種子的萌發(fā)均具有顯著的促進(jìn)作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，目前的花生栽培通常是種子經(jīng)拌種或包衣后進(jìn)行播種，利用菌劑進(jìn)行種子包衣處理不失為一個(gè)提高種子萌發(fā)的有效方式。而辣椒種子常因成熟度不夠、采種技術(shù)不當(dāng)或貯藏方法等原因造成發(fā)芽率降低[22]，研究結(jié)果為利用3株細(xì)菌菌劑進(jìn)行拌種或包衣處理奠定了基礎(chǔ)。

但是，促進(jìn)種子萌發(fā)的菌株不一定會對植株的生長有顯著促進(jìn)作用。張振建等報(bào)道，烏拉爾桿菌PN 133和土壤根瘤桿菌Y 42的浸種均可使莧菜和油麥菜的發(fā)芽率提高，而灌根處理則促生效果并不明顯[23]。利用2株溶磷菌進(jìn)行青稞種子的萌發(fā)試驗(yàn)中，菌株10 BN-11對增加青稞發(fā)芽率及促進(jìn)生長效果明顯，菌株12-BN-6對株高、根長和鮮重具有明顯的促進(jìn)作用，但可抑制種子的萌發(fā)[24]。王艷燕等的研究發(fā)現(xiàn)，在9種可促進(jìn)辣椒發(fā)芽率提高的菌株中，后續(xù)的穴盤育苗有促生效果的僅有4株菌，其中對辣椒下胚軸和主根長度影響顯著的GH 6-1和GH 5-3并未在苗期表現(xiàn)出顯著的促生作用，說明有些菌雖能促進(jìn)種子萌發(fā)，但未必能在后期幼苗生長過程中促進(jìn)其對養(yǎng)分的吸收[25]。本研究的浸種實(shí)驗(yàn)雖顯示3株細(xì)菌均可明顯提高辣椒和花生種子的發(fā)芽率，且不同菌株的處理并無顯著差異；但辣椒種子萌發(fā)后的生長過程中，3株細(xì)菌對其后續(xù)的影響略有不一致；而且，在利用菌液的灌根處理中，發(fā)現(xiàn)P 5菌株對花生幼苗的促生效果顯著高于KKS-6-N 1，GD 3對幼苗株高及鮮重的影響則并不明顯，這也與報(bào)道的相一致。因而對于根際細(xì)菌促生作用的研究中，有必要分別對種子萌發(fā)和幼苗生長進(jìn)行研究，綜合評判根際細(xì)菌菌株的促生作用。

研究顯示，根際促生菌可提高種子的發(fā)芽率和芽長，進(jìn)而提高植株的生物量，但植物對所分離的功能菌株是否具有根際效應(yīng)，是菌株發(fā)揮功能的關(guān)鍵[26]?？蒂O軍等在評價(jià)PseudomonaschlororaphisRA 6 和BacilluspumilusWP 8浸種和拌土對豇豆生長的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌液的浸種處理及108cfu·g-1劑量的菌株拌土處理均可顯著提高豇豆的株高，認(rèn)為浸種處理從原理上講，應(yīng)該不會對非根際土壤產(chǎn)生較大影響[27]。Probanza等研究表明，PGPR對植物土壤中土著微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響可能是其促生的另一個(gè)機(jī)制[28]。研究表明，土壤酶活性與土壤速效養(yǎng)分密切相關(guān)，而土壤微生物數(shù)量大、繁殖快、活性強(qiáng)，直接影響到植物根際有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[29]。因而，為了進(jìn)一步解析和探究P 5菌株對花生幼苗生長的促進(jìn)機(jī)制，本研究對接種P 5菌株的花生根際土壤進(jìn)行了土壤微生物及酶活的測定。由于細(xì)菌、放線菌和真菌是土壤微生物的三大類群，構(gòu)成了土壤微生物的主要生物量，它們的區(qū)系組成和數(shù)量變化能反映土壤生物活性水平[30]。研究結(jié)果顯示，P 5處理組根際土壤中的細(xì)菌總數(shù)較對照增長了2.63倍，真菌總數(shù)增長了2倍，細(xì)菌總數(shù)/真菌總數(shù)之比增加了1.32倍，而放線菌總數(shù)并無明顯差異(p<0.05)。多數(shù)報(bào)道表明，接種促生菌均可不同程度地提高土壤細(xì)菌總數(shù)和放線菌數(shù)，降低真菌數(shù)量[31-33]。王興祥等研究認(rèn)為，細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的一個(gè)生物指標(biāo)，真菌型土壤是地力衰竭的標(biāo)志[34]。但在巨尾桉接種固氮菌或解鉀菌的土壤中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌及放線菌數(shù)量增多，而真菌數(shù)量均不同程度的增高[35]。在研究中，真菌數(shù)量雖有明顯提高，但細(xì)菌數(shù)/真菌數(shù)之比仍高于對照，接種組土壤仍表現(xiàn)為細(xì)菌型土壤。土壤酶活性在一定程度上可以反映土壤肥力狀況。土壤蔗糖酶活性強(qiáng)弱能反映土壤的熟化程度和肥力水平[36]，過氧化氫酶活性與土壤呼吸作用及土壤微生物活動密切相關(guān)[37]，脲酶活性可在一定水平上反映土壤的供氮水平與能力[38]，磷酸酶在土壤有機(jī)磷向無機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化方面起著重要作用[39]。研究顯示，除中性磷酸酶外，P 5接種組的根際土壤蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶均顯著高于對照，表明根際細(xì)菌P 5的處理活躍了土壤微生物；對功能菌群數(shù)量的進(jìn)一步測定結(jié)果表明，氨化細(xì)菌數(shù)、固氮菌數(shù)及溶磷菌數(shù)顯著增高(p<0.05)。氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)量的顯著提高可以提供植物更多所需的氨氮，接種組植株全氮含量的明顯提高與土壤脲酶等酶活性的增高、氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)的顯著提升相一致，這顯然是促進(jìn)花生生長的原因之一。多項(xiàng)研究也已證實(shí)土壤酶活性與大豆、小麥及玉米產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[40-41]。此外，P 5菌株經(jīng)分子鑒定為克雷伯氏菌屬，與KlebsiellavariicolaDX 120 E的同源性最高；而Klebsiellavariicola是2004年才發(fā)現(xiàn)的新種，作為內(nèi)生菌，并由于其優(yōu)良的固氮性能被報(bào)道[42-43]；本研究中的P 5菌株是具有一定固氮能力的茶樹根際細(xì)菌，因而接種了克雷伯氏菌屬的P 5菌株后，顯著提升了花生的全氮含量。值得注意的是，P 5菌株處理的花生全磷含量與對照基本無差異，這與根際土壤中性磷酸酶活無顯著變化相一致，而溶磷菌數(shù)明顯增高的原因還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Klebsiellasp.P 5菌株的浸種處理可以顯著促進(jìn)辣椒和花生種子的萌發(fā)，灌根處理可以顯著促進(jìn)花生幼苗的生長，植株的全氮含量明顯提高，這與根際土壤氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)量的顯著增多，土壤蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶活性的顯著增高直接相關(guān)，研究結(jié)果為下一步利用P 5菌株進(jìn)行拌種或田間施用奠定了理論基礎(chǔ)。