鮑綠地

摘要：過(guò)去的十年，肺癌的發(fā)病率和死亡率顯著增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。因缺乏敏感和有效的早期診斷指標(biāo)以及發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、化療耐藥等影響，肺癌患者總體5年生存率并不樂(lè)觀?，F(xiàn)在有研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的相關(guān)生物樣本中能篩選驗(yàn)證出諸多差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，并且環(huán)狀RNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，有望作為肺癌早期診斷及預(yù)測(cè)治療預(yù)后的一種新型生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA的篩選驗(yàn)證技術(shù)也在不斷地被探索研究。本文結(jié)合最新的研究，對(duì)環(huán)狀RNA與肺癌相關(guān)性及其篩選驗(yàn)證的研究進(jìn)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：環(huán)狀RNA;肺癌;生物標(biāo)志物;篩選驗(yàn)證

【中圖分類號(hào)】R56;R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2020）10-174-02

據(jù)報(bào)道，在過(guò)去的十年里肺癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。肺癌中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的組織病理學(xué)亞型，包括大細(xì)胞肺癌（LCC）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）和肺腺癌（LAD）。如今NSCLC的治療取得了很大進(jìn)展，早期NSCLC經(jīng)手術(shù)治療后患者5年生存率可達(dá)70%-90% ，但因缺乏敏感和有效的早期診斷指標(biāo)以及發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、化療耐藥影響，約75%的患者在就診時(shí)已是進(jìn)展期或晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間，使得非小細(xì)胞肺癌患者的總體5年生存率很低，而小細(xì)胞肺癌（ SCLC）在肺癌中僅占約15%，但是SCLC更具侵襲性，超過(guò)90%的患者在診斷時(shí)已是晚期，患者5年生存率僅為5%^[1]。為此，迫切需要尋找肺癌早期診斷和治療的生物標(biāo)志物，以供臨床能實(shí)施早期并且準(zhǔn)確的干預(yù)，讓肺癌患者的預(yù)后得到有效地改善。

1肺癌中的環(huán)狀RNA

1.1肺癌組織細(xì)胞的環(huán)狀RNA

1.1.1非小細(xì)胞肺癌

差異表達(dá)的環(huán)狀RNA作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性核糖核酸（ceRNA）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。張韶巖等^[2]對(duì)NSCLC癌組織與癌旁組織的表達(dá)譜變化進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA共有171種，高表達(dá)的circRNA有148種，低表達(dá)的有23種，其中高表達(dá)差異3倍以上的37種，低表達(dá)差異3倍以上的有2種。另外，經(jīng)篩選驗(yàn)證在非小細(xì)胞肺癌的組織細(xì)胞中，CCIRC_ZKSKAN1^[1]，hsa_circ_0014130^[3]，circ_ABCB10^[4]，circFOXM1^[5]，circNT5E^[6]，circAcAcA^[7]，Circ_CMPK1^[8]，circHIPK3^[9]，Hsa_circ_0003998^[10]表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。circ 0072309^[11]，circ_0078767^[12]表達(dá)上調(diào)，可阻斷非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。circRNA circPIP5K1A^[13]，Has_circ_0014130^[14]，has_circ_0079530^[14]，circ0003645^[15]表達(dá)上調(diào)，與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后有關(guān) 。這些環(huán)狀RNA都有望成為非小細(xì)胞肺癌有前途的生物標(biāo)志物。

肺腺癌（LAD）約占所有肺癌亞型的40%，是全世界與癌癥相關(guān)的死亡的最常見(jiàn)原因。LAD患者的平均生存率很低，為4%至17%^[16]?，F(xiàn)有研究表明，在肺腺癌組織細(xì)胞中，circ_CRIM1^[17]表達(dá)上調(diào)，會(huì)抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，hsa_circ_0000326^[18]，Circ_ZNF609^[19]，CDR1_AS^[20]，CircCRIM1^[21]，circ_CAMK2A^[22]，circ0012673^[23]，hsa_circ_0014130^[24]表達(dá)上調(diào)，會(huì)影響肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，預(yù)后。這些環(huán)狀RNA可以成為肺腺癌有前途的生物標(biāo)志物。

肺鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型. 有研究證實(shí)，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821可以作為L(zhǎng)AD和LSCC的潛在生物標(biāo)志物，而hsa_circ_0001495可能是LSCC的診斷生物標(biāo)志物^[25]。

1.1.2小細(xì)胞肺癌

與非小細(xì)胞肺癌相比，小細(xì)胞肺癌（SCLC）具有惡性度高、容易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。目前對(duì)小細(xì)胞肺癌相關(guān)環(huán)狀RNA的研究較少見(jiàn)報(bào)道。最近Li 等研究表明，F(xiàn)LI1外顯子circRNA（FECR）是SCLC的致癌因素，F(xiàn)ECR1（外顯子4-2-3）和FECR2（外顯子5-2-3-4）在SCLC組織細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)，并且與淋巴結(jié)呈正相關(guān)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)LI1該基因可能通過(guò)編碼FLI1癌蛋白并產(chǎn)生FECRs在SCLC的發(fā)病過(guò)程中起雙重作用，可用作追蹤SCLC疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物^[26]。

1.2肺癌血液外泌體的環(huán)狀RNA

外泌體是一類納米級(jí)的（30-150 nm）細(xì)胞外囊泡，能被大多數(shù)類型的細(xì)胞脫落并在體液（如血液，尿液，唾液和母乳）中循環(huán)，其內(nèi)容物廣泛，有各種生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、長(zhǎng)的非編碼RNA和環(huán)狀RNA（circRNA）組成。外泌體作為細(xì)胞間的重要載體，可將蛋白質(zhì)、核糖核酸和其他成分從細(xì)胞傳遞到細(xì)胞外空間，通過(guò)在細(xì)胞通訊中起重要信使作用，對(duì)疾病的病理生理過(guò)程起著重要影響。Li等^[27]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在血清外泌體中是穩(wěn)定存在的，其形態(tài)仍然是完整的圓形環(huán)狀，而且大部分circRNA的半衰期長(zhǎng)于mRNA，大多數(shù)物種的circRNA半衰期超過(guò)了48 小時(shí)。也有研究表明，環(huán)狀RNA在體液（包括血清外體、血漿和唾液）中更加豐富和穩(wěn)定，在人唾液和外周血中，數(shù)百種環(huán)狀RNA比同源線性mRNA表達(dá)更高，更容易檢測(cè)。肺癌患者的血漿外泌體中也存在環(huán)狀RNA差異表達(dá)，環(huán)狀RNA有可能是非侵入性檢查中較理想的生物標(biāo)志物。

1.2.1非小細(xì)胞肺癌

經(jīng)篩選驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有一種由主要位于細(xì)胞質(zhì)中的EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的融合環(huán)狀RNA（F-circEA），明確存在于EML4-ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌患者血漿中，F(xiàn)-circEA可能是非小細(xì)胞肺癌的新型液體活檢生物標(biāo)志物^[28]。非小細(xì)胞肺癌患者血漿circFARSA 的含量也高于健康對(duì)照組，circFARSA 可能成為 NSCLC 的潛在生物標(biāo)志物^[29]。

此外，在研究肺腺癌患者血漿外泌體中的差異表達(dá)環(huán)狀RNA（circRNA）時(shí)，Chen等^[30]共篩選了182種差異表達(dá)的外泌體circRNA，與對(duì)照組相比，LAD患者血漿中有105個(gè)上調(diào)和78個(gè)下調(diào)，包括circ_0001492，circ_0001346，circ_0000690和circ_0001439在內(nèi)的四個(gè)上調(diào)的circRNA與qRT-PCR的測(cè)序數(shù)據(jù)相同，揭示了LAD患者血漿樣品中外體circRNA表達(dá)的改變，并支持了探索其作為生物標(biāo)志物的潛力和肺癌的病理效應(yīng)的需求。

Wang等^[31]也提出，hsa_circ_0014235和hsa_circ_0025580可作為（LSCC）的新型診斷生物標(biāo)志物，經(jīng)臨床研究后他們首次揭示了外泌體circRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)譜，并顯示了circRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要診斷潛力。

1.2.2小細(xì)胞肺癌

有研究顯示，與對(duì)照組相比，小細(xì)胞肺癌（SCLC）中的血清外體circRNA（FECR1）異常上調(diào)，血清外泌體FECR1表達(dá)水平伴隨著小細(xì)胞肺癌的臨床化療改變，血清外體FECR1可以作為追蹤SCLC疾病進(jìn)展的有前途的生物標(biāo)記^[26]。

2環(huán)狀 RNA 的篩選驗(yàn)證

環(huán)狀 RNA的篩選驗(yàn)證技術(shù)一直在被探索研究，但目前對(duì)環(huán)狀RNA的研究仍然還存在困難，如環(huán)狀 RNA因結(jié)構(gòu)特殊沒(méi)有游離的 3′和 5′端，無(wú)法用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選驗(yàn)證;標(biāo)本中環(huán)狀RNA通常表達(dá)量較低，不便于檢測(cè)。大量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，可在測(cè)序結(jié)果中尋找兩個(gè)重排外顯子之間的結(jié)點(diǎn)，來(lái)篩選可能存在的環(huán)狀 RNA。隨著科技發(fā)展也出現(xiàn)了許多商業(yè)化篩選技術(shù)，如高通量測(cè)序又名二代測(cè)序、基因芯片。其中高通量測(cè)序成本較高，但可以發(fā)現(xiàn)新的環(huán)狀 RNA，而基因芯片成本相對(duì)較低，只能篩選已知的環(huán)狀 RNA。

目前在實(shí)驗(yàn)室中主要有以下幾種環(huán)狀 RNA驗(yàn)證方法：（1） RT-PCR 定量法：針對(duì)環(huán)狀 RNA 的反向剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)發(fā)散引物，使環(huán)狀RNA按預(yù)期擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger 測(cè)序確認(rèn)環(huán)狀RNA。（2）探針雜交法：RNase H 是一個(gè)可以降解 RNA-DNA中RNA分子的核酸內(nèi)切酶。當(dāng)兩個(gè)短的 DNA 探針雜交至目的RNA分子時(shí)，若該RNA分子為線性，則在 RNase H 消化后電泳出現(xiàn)三條帶;若該RNA分子為環(huán)狀，則為兩條帶，根據(jù)電泳條帶即可驗(yàn)證環(huán)狀RNA。（3）二維變性聚丙烯酰胺凝膠（2D-PAGE）電泳：根據(jù)環(huán)狀RNA的遷移率比線性 RNA 分子要慢，在2D-PAGE中線性RNA沿對(duì)角線遷移而環(huán)狀 RNA 則弧向遷移來(lái)鑒別驗(yàn)證。在實(shí)際研究中往往需結(jié)合以上多種方法來(lái)驗(yàn)證環(huán)狀RNA。

另外，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一些RNA檢測(cè)技術(shù)也可以為環(huán)狀RNA篩選驗(yàn)證的研究和未來(lái)發(fā)展提供新思路。如依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）技術(shù)和CRISPR基因編輯技術(shù)。NASBA技術(shù)，是檢測(cè)RNA的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，適用于很多RNA樣品的分析。而基于CRISPR的聯(lián)合檢測(cè)工具可以整合常見(jiàn)分子診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，既有qPCR、數(shù)字PCR等其它分子診斷技術(shù)的卓越性能，也比其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有更好的靈敏度和特異性。

3 討論與展望

近些年環(huán)狀 RNA的研究掀起了肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，已有研究證實(shí)，環(huán)狀 RNA在肺癌中穩(wěn)定異常表達(dá)，具有良好的靈敏度與特異性，與肺癌不良預(yù)后相關(guān)，為肺癌的早期診斷與預(yù)后標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)提供了新希望。

但目前環(huán)狀 RNA與肺癌相關(guān)性的研究還處于基礎(chǔ)階段，仍存在一些局限性：（1）大多數(shù)研究?jī)H限于NSCLC，circRNA在SCLC患者中的價(jià)值研究較少。（2）大多數(shù)研究集中于腫瘤組織與正常鄰近組織之間的差異表達(dá)比較，其他生物樣本，如血清、血漿或痰液中circRNA的表達(dá)與診斷價(jià)值研究較少。（3）研究多數(shù)僅基于單中心、小樣本的單個(gè)circRNA研究。需要針對(duì)多個(gè)circRNA構(gòu)建肺癌相關(guān)的circRNA組（circRNA panel）進(jìn)行研究才更具臨床價(jià)值。不過(guò)隨著生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，相信circRNA的研究會(huì)出現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景，很有可能成為肺癌潛在的早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后及治療的標(biāo)志物。同時(shí)隨著環(huán)狀RNA篩選驗(yàn)證技術(shù)的研究發(fā)展，環(huán)狀RNA將為肺癌的精準(zhǔn)治療提供新策略。

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