周 亮，向 濱，潘玉龍，何 犇，陳永江，卓 暉，李 強(qiáng)

(成都市第三人民醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610031)

前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因協(xié)同作用的過(guò)程，微小RNA(microRNA，miRNA)作為信使RNA的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)大量研究顯示miRNA與前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[1-2]。為闡明前列腺癌分子生物學(xué)機(jī)制指明了新的研究方向。miR-372屬于miR-371-3基因簇，可轉(zhuǎn)錄成多順?lè)醋樱琺iR-371-3的前體為pri-miR-371-3，能形成4種成熟的miRNAs (miR-371、miR-372、miR-373和miR-373P)[3]。近來(lái)有報(bào)道顯示miR-372與腎癌、腸道腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[4-6]。但是與前列腺癌相關(guān)性的報(bào)道極少，本課題組設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)miR-372在前列腺癌中的表達(dá)及對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移的影響初步報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2017年以來(lái)在我院行前列腺穿刺或前列腺癌根治手術(shù)患者的標(biāo)本及臨床病理資料，所有腫瘤標(biāo)本最后均確認(rèn)為前列腺癌。新鮮標(biāo)本編號(hào)，一部分放入液氮罐轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，一部分送病理科。最后取有效?biāo)本64例，患者平均年齡73(58～82)歲、Gleason評(píng)分≥7分47例、轉(zhuǎn)移病例36例、分期≥T2期38例。所有標(biāo)本均向患者及家屬說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮瓦^(guò)程，報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)并簽署知情同意書(shū)。人前列腺癌LNCaP、DU145細(xì)胞系由廣州萊德?tīng)柹锟萍加邢薰咎峁?/p>

1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、cDNA 合成和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)采用 Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒，均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Gibico公司；Trizol試劑購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNeasy提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Qiagen公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-372引物、無(wú)關(guān)對(duì)照miR-372 negative control(NC)、miR-372 mimics(模擬物)和miR-372 inhibitor(抑制物)委托上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1miR-372在前列腺癌和癌旁組織中的表達(dá) 前列腺癌和癌旁組織分離由我院病理科采用激光顯微切割方法進(jìn)行。采用Trizol試劑將組織中的總RNA(含miRNAS)提取出來(lái)，采用 TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit 合成 cDNA(含特異性引物)； 依據(jù)TaqManTMMicroRNA Cells-to-CTTMKit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)miR-372的表達(dá)，U6為內(nèi)參，miR-372上游引物5′-AAAGTCATAGCATAGAGTGACCTC-3′，下游引物5′-GGGATCAGAGTATAGCCTGAATTA-3′。反應(yīng)體系及程序如下：cDNA 模板(2 μL)，SYBER Green Master Mix(5 μL)，前向引物(1.5 μL)，反向引物(1.5 μL)，ddH2O(1 μL)；95 ℃ 15 min，94 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s。以2-ΔΔCt計(jì)算miR-372的相對(duì)含量。

1.3.2前列腺癌DU145和LNCaP細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌DU145和LNCaP細(xì)胞用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、于37 ℃含5%CO2(體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)箱中孵育。每2 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞豐度達(dá)80%時(shí)傳代或用于實(shí)驗(yàn)研究

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌DU145和LNCaP細(xì)胞鋪于6孔板中，待生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后進(jìn)行miR-372 mimics (45 nmol/L)、miR-372 inhibitor (45 nmol/L)及其對(duì)應(yīng)無(wú)關(guān)對(duì)照序列(negative control,NC)的轉(zhuǎn)染。具體操作步驟按照Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，12 h后更換培養(yǎng)基，24 h后去上清收集細(xì)胞進(jìn)行RNA檢測(cè)。

1.3.4qRT-PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后DU145和LNCaP細(xì)胞中miRNA-372的表達(dá)量 細(xì)胞樣本采用胰酶消化離心收集后，每組樣本加入2 mL Trizol試劑裂解。按照Trizol法步驟提取各組細(xì)胞總RNA，具體操作步驟同(1.3.1)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染完成后取各轉(zhuǎn)染組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于24孔板，細(xì)胞密度9×104/孔，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞呈現(xiàn)單層貼壁生長(zhǎng)時(shí)，用10 μL的消毒槍頭在24孔板垂直劃痕，并劃好標(biāo)記。然后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，換無(wú)血清培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察同一位置不同時(shí)間點(diǎn)(0、24 h)劃痕寬度變化情況并拍照，圖片使用IPP軟件分析，使用Image J測(cè)量細(xì)胞劃痕面積，并計(jì)算遷移率。以24 h細(xì)胞遷移率計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)，遷移率為(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。LNCaP、DU145細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，隨機(jī)無(wú)序干擾的LNCaP、DU145細(xì)胞(NC)作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌和癌旁組織中miR-372的表達(dá)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-372在64例前列腺癌組織中的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(2.068±0.626vs.7.550±1.951)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1)。

2.2 miR-372的表達(dá)與前列腺癌臨床病理的關(guān)系按照前列腺癌患者年齡、臨床分期、病理評(píng)分、是否轉(zhuǎn)移分組，發(fā)現(xiàn)miR-372的表達(dá)在不同患者年齡、Gleason評(píng)分、TNM分期和轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 miR-372的轉(zhuǎn)染效率使用合成的無(wú)序隨機(jī)干擾miR-372序列(NC組)、miR-372模擬物(miR-372 mimics 組)、抑制物(miR-372 inhibitor組)轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP和DU145細(xì)胞組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總的RNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-372的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-372 mimics能上調(diào)前列腺癌細(xì)胞中miR-372的表達(dá)，而miR-372 inhibitor能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞中miR-372的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。證明轉(zhuǎn)染有效，可用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

2.4 miR-372轉(zhuǎn)染對(duì)前列腺癌LNCaP和DU145細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示，LNCaP細(xì)胞中，miR-372 NC組在24 h時(shí)細(xì)胞遷移率為60%，顯著低于inhibitor組的97%(P=0.001)，高于mimics組的25%(P<0.001)；DU145細(xì)胞中，miR-372 NC組在24 h時(shí)細(xì)胞遷移率為64%，顯著低于inhibitor組的96%(P<0.001)，高于mimics組的35%(P<0.001)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-372后前列腺癌細(xì)胞的遷移能力有明顯變化(圖3、4)。

圖2 各轉(zhuǎn)染組miR-372在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖3 miR-372各轉(zhuǎn)染組前列腺癌細(xì)胞遷移情況

圖4 細(xì)胞遷移率比較的統(tǒng)計(jì)曲線

3 討 論

早期診斷和治療可以有效提高腫瘤患者的生存率。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤和組織miRNA的表達(dá)譜發(fā)生變化，并且這些miRNA表達(dá)的異常改變與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。miRNA可以穩(wěn)定存在于血液、血清、尿液中，所以越來(lái)越多的研究致力于探討miRNA作為非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)腫瘤的可行性。

已有報(bào)道顯示miRNA-372在多種腫瘤組織中表達(dá)異常。TU等[8]報(bào)道m(xù)iR-372表達(dá)上調(diào)與口腔癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。WU等[9]報(bào)道在肝癌腫瘤轉(zhuǎn)移中，miR-372的表達(dá)水平顯著降低。miR-372在多種腫瘤組織中的不同表達(dá)可能與miR-372對(duì)下游不同基因調(diào)控水平的差異有關(guān)，并且其可能參與了不同的腫瘤分子水平信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)miR-372在前列腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明其可能為前列腺癌的抑癌因子，分析顯示miR-372的表達(dá)水平與前列腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)，特別是與前列腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系更為緊密。這與KONG等[10]的報(bào)道相似，他們發(fā)現(xiàn)miR-372的低水平表達(dá)與淋巴結(jié)陽(yáng)性的前列腺癌關(guān)系密切。說(shuō)明miR-372可能參與了前列腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程，且有作為前列腺癌預(yù)測(cè)和診斷的分子標(biāo)記物的潛力，本研究設(shè)計(jì)了細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示抑制miR-372后，前列腺癌DU145和LNCaP細(xì)胞遷移率明顯增強(qiáng)。那么到底miR-372參與調(diào)控前列腺癌的分子機(jī)制是什么呢？上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞失去極性，降低細(xì)胞間的粘連能力，獲得組織間質(zhì)形態(tài)的一個(gè)過(guò)程，EMT與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系目前已經(jīng)被證實(shí)[11]。FAN等[12]發(fā)現(xiàn)miR-372可通過(guò)WNT信號(hào)途徑，影響肺腺上皮EMT過(guò)程從而導(dǎo)致肺癌的進(jìn)展。KONG等[10]研究顯示miR-372通過(guò)核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路靶向抑制P65基因，影響前列腺癌細(xì)胞的遷移和增殖從而達(dá)到抑癌作用。

本研究進(jìn)一步通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-372可能對(duì)下游多達(dá)92個(gè)基因具有調(diào)控作用，其中鋅指蛋白(zinc finger protein,ZNF)家族較為重要。已知ZNF家族基因編碼蛋白與核酸相互作用，具有多種功能。其具有的鋅指結(jié)構(gòu)域是一個(gè)保守的氨基酸序列基序，包含2個(gè)特定位置的半胱氨酸和2個(gè)參與鋅配位的組氨酸。而且，ZNF家族作為轉(zhuǎn)錄因子多參與其下游調(diào)控，共同促進(jìn)疾病進(jìn)展[13]。本研究推測(cè)miR-372也可能通過(guò)調(diào)控ZNF家族進(jìn)一步影響下游分子水平促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展。miR-372在前列腺癌組織中低表達(dá)，并且這種低表達(dá)和前列腺癌的臨床分期、病理分級(jí)和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性，抑制miR-372的表達(dá)可明顯增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的活力，加速其遷移，說(shuō)明miR-372對(duì)前列腺癌具有抑制作用。腫瘤的分子調(diào)控是復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，單一研究并不能解釋清楚機(jī)理。對(duì)于miR-372而言，其多通路和多分子水平調(diào)控才是對(duì)前列腺癌影響的關(guān)鍵。下一步我們將進(jìn)行多信號(hào)通路、多分子水平的基因調(diào)控實(shí)驗(yàn)闡釋miR-372抑制前列腺癌的分子網(wǎng)路機(jī)制。