何芝菲

（重慶市潼南區(qū)疾病預防控制中心，重慶402660）

氯氰菊酯是一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑，其殺蟲活性較高，對光和熱均比較穩(wěn)定，廣泛用于蔬菜、水果的殺蟲[1]。氯氰菊酯在環(huán)境中的半衰期長，在自然條件下難以快速降解。因此大量長期使用，必然會造成蔬菜、水果中氯氰菊酯殘留較高的情況[2]。盡管氯氰菊酯毒性相對較低，但食用殘留量較高的食品后會對人們的身體健康帶來巨大的威脅。近年來，隨著我國與西方國家農(nóng)產(chǎn)品進出口貿(mào)易的發(fā)展，一些西方國家調整了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的標準，造成我國農(nóng)產(chǎn)品出口的標準更加嚴格。為解決這一問題，急需尋求一種安全有效的途徑來降解農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的殘留[3]。

利用微生物來降解土壤中的農(nóng)藥是一種最主要、最徹底的凈化方式。而對農(nóng)藥有降解作用的微生物主要有細菌、放線菌、真菌等[4]?？莶菅挎邨U菌就具有降解能力，因此利用枯草芽孢桿菌降解土壤中農(nóng)藥技術研究具有十分重要的意義。生物修復方法是指利用生物本身或生物產(chǎn)品來降解污染物，此方法具有無毒、無殘留等優(yōu)點，其使用成本較低，且能有效消除農(nóng)藥殘留或者降低殘留農(nóng)藥毒性[5]。以生物修復（Bioremediation）為理論基礎的農(nóng)藥殘留降解菌技術應運而生，該技術高效、無毒、無二次污染，而且經(jīng)濟實用，操作簡單，是一種降解農(nóng)藥的重要方法[6]，目前國內外已有相關研究報道。

本實驗擬采用高效液相色譜法測定1株分離自重慶市潼南區(qū)某果園的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，編號A-1）對氯氰菊酯的降解率，為該菌的進一步研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

A-1，分離自重慶市潼南區(qū)某果園的1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），初篩表現(xiàn)出對氯氰菊酯有一定降解作用，現(xiàn)由重慶市潼南區(qū)疾病預防控制中心微生物實驗室保存。

1.2 主要儀器及試劑

LC-10A2010C HT液相色譜儀（日本島津公司），附LC-solution工作站（日本島津公司）；Satorius CP225D型電子天平（德國塞多利斯公司）；SORVALL pico型高速離心機（美國ABI公司）；Mill-Q超純水儀等（德國密理博公司）。

正己烷(華大)、丙酮(華大)、二氯甲烷(華大)、乙腈（TEDIA）、甲醇（TEDIA）等

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將A-1劃線于（含氯氰菊酯100 mg/L）LB斜面，30 ℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下并調整細胞濃度約為108個/mL，制成種子液。

將A-1種子液接種于100 mg/L氯氰菊酯的LB培養(yǎng)基中，接種量5%，分裝于30 mL/瓶。同時接種5%無菌水為空白對照，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)120 h，測定A-1對氯氰菊酯的降解情況。

1.3.2 氯氰菊酯的提取與降解率測定

取1 mL均勻培養(yǎng)液，加入1 mL乙腈，超聲波破碎30 min，用乙腈定容至10 mL，于13 000r /min離心10 min，將上清液用0.45μm的有機相濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液供液相色譜分析用。測定條件：色譜柱為Gemini 100? C18柱（5.0 μm，150 mm×4.60 mm）；流動相為乙腈-水（76∶24，v/v），流速1.0 mL/min；紫外檢測器波長為210 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2 結果與分析

A-1在1.3.1條件下經(jīng)120 h培養(yǎng)，除去對照組氯氰菊酯的損失部分，采用歸一法進行計算，實驗結果得出空白對照中農(nóng)藥含量為7.24%，樣品液中殘留農(nóng)藥含量為5.05%。依據(jù)降解率計算公式得出實驗組中30.25%氯氰菊酯被A-1降解（圖1）。說明此株菌對氯氰菊酯具有降解能力，A-1對氯氰菊酯降解率為30.25%。

3 結論與討論

圖1 A-1的氯氰菊酯的液相色譜圖

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）可降解的農(nóng)藥類型較多，如有機磷、有機氯等殺蟲劑、甲磺隆等除草劑。但是國內對于枯草芽孢桿菌對氯氰菊酯的研究較少，因此還有很大的后續(xù)研究空間?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌中具有較大應用潛力的菌種之一，枯草芽孢桿菌可作為微生物農(nóng)藥，在抑制植物病原菌生物防治領域也有良好的作用。枯草芽孢桿菌作為植物生防細菌之一，具有較強的防病作用。雖然A-1已被證實對氯氰菊酯具有一定的降解的能力，但要將其用于制備微生物制劑還必須對其進行一系列的生理學特征的鑒定以及其他相關研究。除此之外，還應對A-1用小白鼠進行毒性實驗，從而保證安全性。

如果經(jīng)過以上各項試驗后，表現(xiàn)出良好的降解能力且無毒，則可以考慮將其作為微生態(tài)制劑的候選菌種開發(fā)。隨著微生態(tài)制劑的發(fā)展及其研究的不斷深入，將來多種微生物復合的微生態(tài)制劑研究將向高技術、高產(chǎn)量、高質量方向發(fā)展，具有廣泛的市場空間。目前對于枯草芽孢桿菌降解氯氰菊酯的報道較少，對此的研究還遠遠不夠。本實驗中的菌株可以進行動物毒理學實驗，進一步研究該菌株是否為益生菌，如何將枯草芽孢桿菌制成生物制劑并廣泛應用，枯草芽孢桿菌中酶提取以及枯草芽孢桿菌在表達系統(tǒng)中的應用等，都是需要在未來進一步研究的問題。