張瑞騰

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原030025）

腫瘤是生物基體的某些局部組織受到致癌因素的影響而在基因手繪屏上失去了其正常生長(zhǎng)調(diào)控能力，從而表現(xiàn)為克隆性異常增長(zhǎng)的新的細(xì)胞組織。腫瘤發(fā)病率與生物體自身基因組成和生活環(huán)境息息相關(guān)，人們?nèi)粘＝佑|到的食品、大氣、土壤、飲用水、輻射等都可能是造成腫瘤的因素。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)調(diào)查，80%以上的惡性腫瘤均可以通過提高體檢頻率來避免并且及時(shí)治療。因此，積極的診斷是治療腫瘤的重要手段。腫瘤標(biāo)志物會(huì)伴隨腫瘤的生長(zhǎng)而分泌，可以應(yīng)用生物學(xué)、免疫化學(xué)檢測(cè)原料進(jìn)行標(biāo)定，并由臨床腫瘤醫(yī)院提供相關(guān)診斷和治療檢測(cè)信息。通常腫瘤標(biāo)志物處于腫瘤細(xì)胞和組織之間，可以通過血液等體液進(jìn)入到人體其他組織中。且當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于不同的生長(zhǎng)期時(shí)，其表現(xiàn)出的腫瘤標(biāo)志物也有明顯的差異性。因此臨床醫(yī)療可以通過對(duì)腫瘤標(biāo)志物的定性、定量檢測(cè)來提高對(duì)腫瘤的診斷和監(jiān)測(cè)，從而獲得治療所需要的信息。檢測(cè)信息可以幫助醫(yī)生判斷腫瘤患者是否需要進(jìn)行切割手術(shù)和滿足保守治療條件，治療中應(yīng)使用何種級(jí)別藥物及使用劑量等。因此，技術(shù)研究人員不斷探索開發(fā)更先進(jìn)、更全面、更靈敏的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)是非常重要的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

人工合成寡聚核苷酸由生工生物工程（上海）有限公司提供（定義為DNA1DNA2DNA3DNA4）；氫氧化鈉、咪唑、四氯金酸、鹽酸、磷酸二氫鈉、N-羥基琥珀酰亞胺、磷酸氫二鈉、4,4二羧基-2,2-連吡啶等藥品由國(guó)藥化學(xué)試劑公司和阿拉丁化學(xué)試劑公司提供，純度均為分析純。

實(shí)驗(yàn)使用的電致化學(xué)發(fā)光分析儀，采購于西安瑞邁電子科技公司，型號(hào)為MPI-E；

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為Ramos細(xì)胞（CRL-1596，淋巴瘤細(xì)胞），由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)液中青霉素-鏈霉素含量為60 IU/mL，胎牛血清含量為10%；培養(yǎng)溫度為37℃，環(huán)境中二氧化碳含量為5%。抽取腫瘤細(xì)胞樣品的步驟為：使用Petroff-Hausser細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)淋巴瘤細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)量統(tǒng)計(jì)，抽取1.0 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在高速離心機(jī)下離心分離，倒掉離心管內(nèi)上層營(yíng)養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖溶液對(duì)離心管下層的腫瘤細(xì)胞組織進(jìn)行反復(fù)沖洗。沖洗結(jié)束后將腫瘤細(xì)胞組織分散在磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液中。

1.3 LA/SP/Fe3O4@Au復(fù)合物制備

1.3.1 [Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA信號(hào)探針制備

使用三氯化釕和2,2-聯(lián)吡啶為原料，以乙二醇為反應(yīng)介質(zhì)，在圓底燒瓶中反應(yīng)，得到的氯化二聯(lián)吡啶釕中間體用丙酮和乙醚苯萃取洗滌。以氯化二聯(lián)吡啶釕中間體與碳酸氫鈉、4,4二羧基-2,2-連吡啶為原料，以甲醇/水為反應(yīng)介質(zhì)，在圓底燒瓶中加熱回流反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在體系中加入一定量的六氟磷酸鈉，得到棕褐色的二聯(lián)吡啶-4,4-二羧酸-2,2-聯(lián)吡啶合釕六氟磷酸鹽沉淀。以N,N-二甲基甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì)，以二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和二聯(lián)吡啶-4,4-二羧酸-2,2-聯(lián)吡啶合釕六氟磷酸鹽為原料在圓底燒瓶中反應(yīng)，最終得到[Ru(bpy)2(dcbpy)]探針物質(zhì)。配置DNA超純水溶液并加入一定體積0.584 mmol/L的[Ru(bpy)2(dcbpy)]探針物質(zhì)和四硼酸緩沖溶液，攪拌均勻后再加入一定體積醋酸鈉溶液和無水乙醇試劑，在冰浴條件下修飾反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后使用高速離心機(jī)分離，并用低溫乙醇試劑洗滌沉淀物后干燥，得到的[Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA放入到PBS緩沖溶液中備用。

1.3.2 Fe3O4@Au磁性納米核殼結(jié)構(gòu)材料制備

使用檸檬酸鈉還原四氯金酸的方法制備納米金粒子。使用商品磁珠進(jìn)行巰基修飾，修飾后分散在TCEP溶液中老化1 h后加入自制的納米金粒子懸浮液，繼續(xù)震蕩老化反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后用使用PBS緩沖溶液沖洗，干燥，得到Fe3O4@Au磁性納米核殼結(jié)構(gòu)材料。

1.3.3 LA/SP/Fe3O4@Au復(fù)合物制備

[Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA探針溶液置于TCEP溶液中老化1h后加入Fe3O4@Au磁性納米核殼結(jié)構(gòu)材料溶液混合，連續(xù)攪拌16h以上，隨后繼續(xù)加入0.3 mmol/L氯化鈉和10 mmol/L Tris-乙酸溶液繼續(xù)老化48 h。反應(yīng)結(jié)束后通過磁性分離手段脫除結(jié)合的探針，得到LA/SP/Fe3O4@Au復(fù)合物。

2 腫瘤檢測(cè)結(jié)果

將生物素修飾的c-DNA自組裝到鏈霉親合素表面并與自制的LA/SP/Fe3O4@ Au復(fù)合物雜交，然后加入一定數(shù)量的淋巴腫瘤細(xì)胞。隨著細(xì)胞表面蛋白與復(fù)合物的核酸適配體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，部分LA/SP/Fe3O4@Au復(fù)合物會(huì)脫離鏈霉親合素而進(jìn)入到溶液中，使用DNA2和DNA4將腫瘤細(xì)胞表面的復(fù)合物探針繼續(xù)解離到溶液中。最后通過磁性金電極捕獲溶液中的復(fù)合物探針并進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示。

從圖1曲線可以看出，當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)量從1 000增加到100 000時(shí)，體系中的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度成增加趨勢(shì)。以腫瘤細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，強(qiáng)度曲線的峰值為縱坐標(biāo)繪制擬合曲線，發(fā)現(xiàn)二者成線性關(guān)系。通過origin軟件擬合計(jì)算得到擬合方程為I=-858.747+292.8031lgC，其中I為電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，C為淋巴腫瘤細(xì)胞數(shù)量。擬合方程的線性度為0.999 8，說明可以根據(jù)建立的擬合曲線，通過電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度數(shù)值計(jì)算得到腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文制備了一種LA/SP/Fe3O4@ Au復(fù)合物探針，采用磁性電極將解離出的探針進(jìn)行富集，結(jié)合電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，以淋巴腫瘤細(xì)胞組織液為樣品，建立了一種靈敏度高的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法。建立的擬合方程為I=-858.747+292.8031lgC，線性度為0.9998。

圖1 不同數(shù)量淋巴腫瘤細(xì)胞下從鏈霉親合素上解離出的納米復(fù)合物探針的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 不同淋巴腫瘤細(xì)胞數(shù)量下電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)峰高與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系