朱健，卜英悅，朱菁

（1.復旦大學，上海 200433；2.上海藥明生物技術有限公司，上海 200131）

雙特異性抗體（Bispecific Antibody）又稱為雙功能抗體或雙價抗體，可以同時特異性結合2個不同的抗原[1]，由于其特異性和雙功能性，現(xiàn)已成為抗體工程領域的研究熱點，在腫瘤免疫治療及自身免疫疾病等領域中具有廣闊的應用前景。

雙特異性抗體的重組生產(chǎn)通常伴隨著由重鏈同源二聚體化、重鏈和輕鏈的錯配、不同鏈的不平衡表達以及分子間的錯誤分配等導致的目標物中雜質(zhì)的增加（副產(chǎn)物或聚集體）[2]。這些副產(chǎn)物表現(xiàn)出與目標雙抗的高度類似性，在純化工藝中很難被去除[3]。

成熟的抗體純化工藝一般含3步層析工藝，分別是Protein A親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析或疏水層析。Protein A親和層析用于捕獲細胞培養(yǎng)液中的抗體，離子交換層析或者疏水層析用于進一步提高抗體純度，通常稱為精純（Polishing）。陰離子交換層析通常被用于精純工藝，且其應用模式與其他步驟也不同，常采用吸附雜質(zhì)而讓抗體流穿的方式。陰離子填料本身帶正電荷，用于吸附帶負電荷的物質(zhì)[4]。而大多數(shù)抗體的等電點高于7.0，中性環(huán)境下抗體分子一般帶正電荷，所以陰離子填料應用于抗體下游工藝時一般用于吸附帶負電荷的雜質(zhì)，而使目標蛋白流穿，稱之為流穿模式層析。流穿模式層析主要利用的是填料對雜質(zhì)的吸附力，對層析柱的柱效要求較低。由于精純步驟分離的雜質(zhì)和目標抗體本身的差異已經(jīng)很小，想要摸索出合適條件下填料對雜質(zhì)和目標抗體的吸附差異需要對大量填料進行篩選，再加上不同緩沖條件之間的比較，篩選工作量成倍增長。傳統(tǒng)的工藝開發(fā)受限于樣本篩選量，開發(fā)出的工藝往往不是最佳條件。本工藝將原本用于細胞株篩選的全自動液體工作站應用于抗體純化的工藝篩選，開創(chuàng)了純化工藝開發(fā)的新模式[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

化學試劑均為USP級別，供貨商主要為Merck。填料主要是Millipore的EMD TMAE和DEAE；GE Healthcare的Capto Q、Capto Q HP、Capto Q ImpRes、Capto DEAE；TOSOH的Q-600AR、Giga Cap Q-650M、Super Q-650M；Life Tech的Poros系列包括50HQ、XQ、50D、50PI等。所用設備主要是GE Healthcare的液相層析系統(tǒng)?KTA Pure 150M、Tricon 5/150層析柱；Tecan的全自動液體工作站Freedom EVO150；Thermo的紫外分光光度計Nanodrop2000；Mettler Toledo的pH電導率計和電子天平等。

1.2 方法

將供篩選的填料分別加入Greiner 96孔板，該96孔板底部是一層可過濾的膜，通過真空抽濾將填料保存液抽除，確保每個孔中的干膠體積在20 μL左右。再用60 μL以上的平衡液20 mmol/L PB將填料充分混懸后將平衡液抽除。將pH為6.5和7.5的樣品分別加入對應的孔，混懸30 min后將樣品抽出，可重復操作使填料載量達到20 g/L。

抽出的樣品分別進行純度、蛋白A和宿主細胞蛋白、DNA等質(zhì)量分析。單體純度使用HPLC分子排阻法檢測，完整分子純度使用電泳檢測，蛋白A和宿主細胞蛋白殘留使用酶聯(lián)免疫吸附測定，宿主DNA殘留使用定量聚合酶鏈反應測定。

由于高通量篩選技術是基于靜態(tài)吸附的模式進行考查，選擇篩選出的分辨率較高的前3種填料進行裝柱，在層析柱中進行動態(tài)吸附模式的確認，以驗證高通量篩選技術的準確性。

2 結果與分析

2.1 高通量篩選

通過靜態(tài)吸附模式的高通量篩選，各種陰離子填料的表現(xiàn)見表1。收率反應了工藝的產(chǎn)能和效率，所以越高越好；單體純度、SDS-Caliper NR作為產(chǎn)品的純度指標也是越高越好。高聚物、殘留宿主細胞蛋白是純化工藝需要去除的雜質(zhì)，所以越低越好。通過比較分析（見圖1～4），各種填料在SDS-Caliper NR純度上的表現(xiàn)差異不明顯，而從另外幾個關鍵的質(zhì)量指標單體純度和殘留宿主細胞蛋白看，Poros XQ的表現(xiàn)最好。Poros XQ收率低，是因為填料的靜態(tài)吸附能力強，而實際使用時關注的是填料的動態(tài)吸附能力，且可通過降低柱保留時間來調(diào)節(jié)；另外，流穿層析模式可通過增加上樣量來提高回收率。從目前可產(chǎn)業(yè)化的純化技術看，宿主細胞蛋白的去除常常面臨挑戰(zhàn)，且宿主細胞蛋白的量會隨上游表達情況的變化而變化，所以要保證純化工藝的穩(wěn)定性，宿主細胞蛋白的去除能力需要重點關注。從高通量填料篩選的結果看，Poros XQ、Capto Q和Capto DEAE在宿主細胞蛋白去除方面都有不錯的表現(xiàn)，從產(chǎn)品質(zhì)量角度看，Poros XQ表現(xiàn)最佳。

圖1 收率比較圖

圖2 單體純度比較圖

圖3 SDS NR比較圖

表1 高通量篩選質(zhì)量數(shù)據(jù)

圖4 殘留宿主細胞蛋白比較圖

2.2 柱層析

將Poros XQ、Capto Q和Capto DEAE3種填料分別裝進GE Tricorn層析柱，柱直徑0.5 cm，柱高15 cm左右，柱床體積約3 mL。層析系統(tǒng)為GE Pure M150。先用200 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉（PB）對層析柱進行預平衡，再用20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉進行平衡后將蛋白樣品上到層析柱，收集流穿液，測試產(chǎn)品質(zhì)量。同時還比較了3種填料在不同的上樣條件pH為6.5和7.5的表現(xiàn)。上樣樣品的單體純度為91.4%，殘留宿主細胞蛋白量為4 008 mg/L，其他數(shù)據(jù)見表2。基于表2的數(shù)據(jù)進行分析，如圖5、圖6所示，經(jīng)過陰離子流穿層析，Poros XQ和Capto DEAE均能獲得較高純度的抗體單體，純度均在95%以上且pH7.5均略好于pH6.5，同時這兩種填料對宿主細胞蛋白的去除也有很好的表現(xiàn)，能夠將殘留的宿主細胞蛋白從4 008 mg/L降低到200 mg/L左右。從回收率看，Poros XQ和Capto DEAE相對較低，尤其是在pH7.5條件下，但仍在下游工藝可接受范圍內(nèi)。Capto Q收率雖高，但純度指標上的表現(xiàn)均不理想。

表2 柱層析比較

圖5 收率和單體純度比較圖

圖6 殘留宿主細胞蛋白比較圖

從圖7、圖8可知，在進行陰離子流穿層析時，Poros XQ收集液體積約10倍柱體積，而Capto DEAE收集液體積約18倍柱體積，體積越大對放大生產(chǎn)的挑戰(zhàn)越大，成本也越高，所以Poros XQ是最佳選擇，與高通量篩選結果一致。

3 結論

本工藝所研究的雙特異性抗體是IgG1型，等電點為8.6。為了讓盡可能多的雜質(zhì)帶負電荷被填料吸附，在目標蛋白帶正電的前提下使pH盡可能靠近等電點。再結合所選緩沖液的緩沖范圍，使用1mol/L Tris將上一步工藝的產(chǎn)品pH分別調(diào)節(jié)至6.5和7.5。

通過使用高通量篩選技術，相對傳統(tǒng)的篩選模式，拓展了填料和pH的篩選范圍，同時考察了兩個影響因子的交互作用，更精準的捕獲了最具工藝適應性的填料Poros XQ和pH條件。

圖7 Poros XQ層析圖

圖8 Capto DEAE層析圖