朱健，卜英悅，朱菁

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131）

雙特異性抗體（Bispecific Antibody）又稱為雙功能抗體或雙價抗體，可以同時特異性結(jié)合2個不同的抗原[1]，由于其特異性和雙功能性，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的研究熱點，在腫瘤免疫治療及自身免疫疾病等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

雙特異性抗體的重組生產(chǎn)通常伴隨著由重鏈同源二聚體化、重鏈和輕鏈的錯配、不同鏈的不平衡表達以及分子間的錯誤分配等導(dǎo)致的目標(biāo)物中雜質(zhì)的增加（副產(chǎn)物或聚集體）[2]。這些副產(chǎn)物表現(xiàn)出與目標(biāo)雙抗的高度類似性，在純化工藝中很難被去除[3]。

成熟的抗體純化工藝一般含3步層析工藝，分別是Protein A親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析或疏水層析。Protein A親和層析用于捕獲細胞培養(yǎng)液中的抗體，離子交換層析或者疏水層析用于進一步提高抗體純度，通常稱為精純（Polishing）。陰離子交換層析通常被用于精純工藝，且其應(yīng)用模式與其他步驟也不同，常采用吸附雜質(zhì)而讓抗體流穿的方式。陰離子填料本身帶正電荷，用于吸附帶負電荷的物質(zhì)[4]。而大多數(shù)抗體的等電點高于7.0，中性環(huán)境下抗體分子一般帶正電荷，所以陰離子填料應(yīng)用于抗體下游工藝時一般用于吸附帶負電荷的雜質(zhì)，而使目標(biāo)蛋白流穿，稱之為流穿模式層析。流穿模式層析主要利用的是填料對雜質(zhì)的吸附力，對層析柱的柱效要求較低。由于精純步驟分離的雜質(zhì)和目標(biāo)抗體本身的差異已經(jīng)很小，想要摸索出合適條件下填料對雜質(zhì)和目標(biāo)抗體的吸附差異需要對大量填料進行篩選，再加上不同緩沖條件之間的比較，篩選工作量成倍增長。傳統(tǒng)的工藝開發(fā)受限于樣本篩選量，開發(fā)出的工藝往往不是最佳條件。本工藝將原本用于細胞株篩選的全自動液體工作站應(yīng)用于抗體純化的工藝篩選，開創(chuàng)了純化工藝開發(fā)的新模式[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

化學(xué)試劑均為USP級別，供貨商主要為Merck。填料主要是Millipore的EMD TMAE和DEAE；GE Healthcare的Capto Q、Capto Q HP、Capto Q ImpRes、Capto DEAE；TOSOH的Q-600AR、Giga Cap Q-650M、Super Q-650M；Life Tech的Poros系列包括50HQ、XQ、50D、50PI等。所用設(shè)備主要是GE Healthcare的液相層析系統(tǒng)?KTA Pure 150M、Tricon 5/150層析柱；Tecan的全自動液體工作站Freedom EVO150；Thermo的紫外分光光度計Nanodrop2000；Mettler Toledo的pH電導(dǎo)率計和電子天平等。

1.2 方法

將供篩選的填料分別加入Greiner 96孔板，該96孔板底部是一層可過濾的膜，通過真空抽濾將填料保存液抽除，確保每個孔中的干膠體積在20 μL左右。再用60 μL以上的平衡液20 mmol/L PB將填料充分混懸后將平衡液抽除。將pH為6.5和7.5的樣品分別加入對應(yīng)的孔，混懸30 min后將樣品抽出，可重復(fù)操作使填料載量達到20 g/L。

抽出的樣品分別進行純度、蛋白A和宿主細胞蛋白、DNA等質(zhì)量分析。單體純度使用HPLC分子排阻法檢測，完整分子純度使用電泳檢測，蛋白A和宿主細胞蛋白殘留使用酶聯(lián)免疫吸附測定，宿主DNA殘留使用定量聚合酶鏈反應(yīng)測定。

由于高通量篩選技術(shù)是基于靜態(tài)吸附的模式進行考查，選擇篩選出的分辨率較高的前3種填料進行裝柱，在層析柱中進行動態(tài)吸附模式的確認，以驗證高通量篩選技術(shù)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量篩選

通過靜態(tài)吸附模式的高通量篩選，各種陰離子填料的表現(xiàn)見表1。收率反應(yīng)了工藝的產(chǎn)能和效率，所以越高越好；單體純度、SDS-Caliper NR作為產(chǎn)品的純度指標(biāo)也是越高越好。高聚物、殘留宿主細胞蛋白是純化工藝需要去除的雜質(zhì)，所以越低越好。通過比較分析（見圖1～4），各種填料在SDS-Caliper NR純度上的表現(xiàn)差異不明顯，而從另外幾個關(guān)鍵的質(zhì)量指標(biāo)單體純度和殘留宿主細胞蛋白看，Poros XQ的表現(xiàn)最好。Poros XQ收率低，是因為填料的靜態(tài)吸附能力強，而實際使用時關(guān)注的是填料的動態(tài)吸附能力，且可通過降低柱保留時間來調(diào)節(jié)；另外，流穿層析模式可通過增加上樣量來提高回收率。從目前可產(chǎn)業(yè)化的純化技術(shù)看，宿主細胞蛋白的去除常常面臨挑戰(zhàn)，且宿主細胞蛋白的量會隨上游表達情況的變化而變化，所以要保證純化工藝的穩(wěn)定性，宿主細胞蛋白的去除能力需要重點關(guān)注。從高通量填料篩選的結(jié)果看，Poros XQ、Capto Q和Capto DEAE在宿主細胞蛋白去除方面都有不錯的表現(xiàn)，從產(chǎn)品質(zhì)量角度看，Poros XQ表現(xiàn)最佳。

圖1 收率比較圖

圖2 單體純度比較圖

圖3 SDS NR比較圖

表1 高通量篩選質(zhì)量數(shù)據(jù)

圖4 殘留宿主細胞蛋白比較圖

2.2 柱層析

將Poros XQ、Capto Q和Capto DEAE3種填料分別裝進GE Tricorn層析柱，柱直徑0.5 cm，柱高15 cm左右，柱床體積約3 mL。層析系統(tǒng)為GE Pure M150。先用200 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉（PB）對層析柱進行預(yù)平衡，再用20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉進行平衡后將蛋白樣品上到層析柱，收集流穿液，測試產(chǎn)品質(zhì)量。同時還比較了3種填料在不同的上樣條件pH為6.5和7.5的表現(xiàn)。上樣樣品的單體純度為91.4%，殘留宿主細胞蛋白量為4 008 mg/L，其他數(shù)據(jù)見表2?；诒?的數(shù)據(jù)進行分析，如圖5、圖6所示，經(jīng)過陰離子流穿層析，Poros XQ和Capto DEAE均能獲得較高純度的抗體單體，純度均在95%以上且pH7.5均略好于pH6.5，同時這兩種填料對宿主細胞蛋白的去除也有很好的表現(xiàn)，能夠?qū)埩舻乃拗骷毎鞍讖? 008 mg/L降低到200 mg/L左右。從回收率看，Poros XQ和Capto DEAE相對較低，尤其是在pH7.5條件下，但仍在下游工藝可接受范圍內(nèi)。Capto Q收率雖高，但純度指標(biāo)上的表現(xiàn)均不理想。

表2 柱層析比較

圖5 收率和單體純度比較圖

圖6 殘留宿主細胞蛋白比較圖

從圖7、圖8可知，在進行陰離子流穿層析時，Poros XQ收集液體積約10倍柱體積，而Capto DEAE收集液體積約18倍柱體積，體積越大對放大生產(chǎn)的挑戰(zhàn)越大，成本也越高，所以Poros XQ是最佳選擇，與高通量篩選結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本工藝所研究的雙特異性抗體是IgG1型，等電點為8.6。為了讓盡可能多的雜質(zhì)帶負電荷被填料吸附，在目標(biāo)蛋白帶正電的前提下使pH盡可能靠近等電點。再結(jié)合所選緩沖液的緩沖范圍，使用1mol/L Tris將上一步工藝的產(chǎn)品pH分別調(diào)節(jié)至6.5和7.5。

通過使用高通量篩選技術(shù)，相對傳統(tǒng)的篩選模式，拓展了填料和pH的篩選范圍，同時考察了兩個影響因子的交互作用，更精準(zhǔn)的捕獲了最具工藝適應(yīng)性的填料Poros XQ和pH條件。

圖7 Poros XQ層析圖

圖8 Capto DEAE層析圖