郭慶圓 劉洪臣

骨組織含血量約占心排血量的5%～20%，但骨髓是一個(gè)缺氧的微環(huán)境，骨髓中含有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種因子，這些因子調(diào)節(jié)著骨骼各種復(fù)雜的病理、生理活動(dòng)。腫瘤的切除、外傷、感染或其他原因?qū)е碌墓侨睋p，損傷后血流中斷或減少而導(dǎo)致局部缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)是機(jī)體組織、細(xì)胞適應(yīng)低氧或缺氧環(huán)境的主要調(diào)節(jié)因子，包括HIF-1α 和HIF-2α。常氧條件下，HIF-1α 和HIF-2α 被脯氨酰羥化酶(PHD)羥基化，使HIF-1α 與腫瘤抑制蛋白(pVHL)結(jié)合，從而導(dǎo)致pVHL 的泛素化和HIF 蛋白的降解[1]。在缺氧條件，PHD 活性下降，HIF 蛋白α 亞基的積累，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，并與HIF 靶基因上的缺氧反應(yīng)元件(HRES)結(jié)合[2]。缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活化影響許多細(xì)胞過程，包括血管生成和糖酵解，從而調(diào)節(jié)骨骼的發(fā)育、修復(fù)及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。研究表明HIF 可調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖酵解酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)[3]，這些靶基因的產(chǎn)物參與細(xì)胞凋亡、能量代謝、紅細(xì)胞生成和血管生成等多種病理生理過程，在細(xì)胞和機(jī)體的生理反應(yīng)中至關(guān)重要。因此，在機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境的過程中，HIF-1 起著關(guān)鍵的作用。對(duì)于骨骼系統(tǒng)，HIF 對(duì)骨和軟骨的形成也是十分重要的。骨骼系統(tǒng)中存在多種缺氧反應(yīng)，HIF 在其中發(fā)揮著重要的作用[4]。

1.HIF的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特點(diǎn)

HIF 對(duì)維護(hù)細(xì)胞的氧平衡是必不可少的。HIF有三種亞型：HIF-1、HIF-2 和HIF-3。每種亞型都是由α 和β 亞基構(gòu)成的異二聚體，Semenza等[5]發(fā)現(xiàn)了HIF-1 蛋白能特異性地結(jié)合于促紅細(xì)胞生成素基因的缺氧反應(yīng)元件上，HIF 的α 亞單位包含兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域：N 端(N-TAD)和C 端(C-TAD)。N-TAD 與氧依賴性降解(ODD)域重疊，從而導(dǎo)致α 亞基結(jié)合到VHL 抑癌蛋白上泛素化隨后被降解[6]。PHD 是一種氧傳感器，它的活性至關(guān)重要，并且受氧張力調(diào)節(jié)。在缺氧條件下PHD 是不活躍的甚至無效的，導(dǎo)致α 亞基積累并被輸入細(xì)胞核。β 亞基是穩(wěn)定的，可以檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核處于常氧還是缺氧條件下。HIF 的α-β二聚體結(jié)合到HIF 靶基因的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的HRE 上，從而啟動(dòng)負(fù)責(zé)缺氧適應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄。至今已發(fā)現(xiàn)四種PHD 和10 多個(gè)由HIF 調(diào)節(jié)的靶基因。這些HIF 調(diào)節(jié)的基因參與細(xì)胞生物行為的多個(gè)方面，包括促紅細(xì)胞生成素，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和VEGF。在不同組織有不同的HIF 亞型的表達(dá)并且不同的亞型發(fā)揮著不同的作用[7]。

HIF 不僅被缺氧調(diào)節(jié)，也被一些金屬離子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超聲波和一些細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等調(diào)節(jié)[8]。一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)控制著HIF 調(diào)節(jié)體系，其中涉及多個(gè)調(diào)控機(jī)制，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、核運(yùn)輸及由下游基因形成的反饋回路。不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也可以通過磷酸化的α-亞基調(diào)節(jié)HIF，包括(PI3K)/AKT，p38，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[9]。

2.HIF介導(dǎo)骨發(fā)育

骨發(fā)育主要有兩種不同的形成機(jī)制，骨膜成骨或軟骨內(nèi)成骨。除了顱面骨發(fā)育是由間充質(zhì)細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞(骨膜內(nèi)成骨)以外，其他的骨骼均來自軟骨原基礦化成骨，這一過程被稱為軟骨內(nèi)成骨。軟骨內(nèi)成骨過程中，間充質(zhì)細(xì)胞凝聚分化為軟骨細(xì)胞，形成胚胎生長(zhǎng)板。生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，在分裂時(shí)，它們也會(huì)堆積形成柱狀層。柱狀層的最遠(yuǎn)端細(xì)胞停止增殖，退出細(xì)胞周期，分化為肥大軟骨細(xì)胞，礦化其周圍基質(zhì)。隨后，血管侵入軟骨膜在骨化中心礦化成骨[10]。

缺氧信號(hào)通路是骨發(fā)育的關(guān)鍵。胚胎生長(zhǎng)板是一種獨(dú)特的間充質(zhì)組織(因?yàn)樗侨毖缘?，由于其無血管性，胚胎生長(zhǎng)板具有內(nèi)缺氧區(qū)。遺傳實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α 是體內(nèi)這些缺氧的軟骨細(xì)胞存活的關(guān)鍵因子，HIF-1α 缺乏將導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)板缺氧區(qū)內(nèi)大量細(xì)胞死亡。此外，間充質(zhì)凝聚的肢芽也是缺氧的，肢芽?jī)?nèi)HIF-1α 缺乏將阻滯間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞[11]。

VEGF 是HIF-1α 和HIF-2α 作用的目標(biāo)，它不僅在調(diào)節(jié)血管生成和軟骨骨化的肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)，也在胚胎生長(zhǎng)板內(nèi)缺氧區(qū)內(nèi)表達(dá)。選擇性敲除小鼠VEGF 基因?qū)е律L(zhǎng)板細(xì)胞死亡，相似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在HIF-1α 缺失的發(fā)育軟骨中。此外，在增殖的軟骨細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)需要軟骨有足夠的氧氣供應(yīng)，這由軟骨膜內(nèi)血管生成來實(shí)現(xiàn)。因此，HIF-1α 在缺氧性軟骨細(xì)胞中的促生長(zhǎng)功能可能完全或部分通過其下游靶點(diǎn)VEGF 介導(dǎo)。然而，Maes 等對(duì)這一假設(shè)的驗(yàn)證表明，軟骨中HIF-1α基因敲除的致死作用只能通過VEGF 轉(zhuǎn)基因表達(dá)部分恢復(fù)，提示VEGF 依賴細(xì)胞存在自主機(jī)制。特別是在軟骨細(xì)胞內(nèi)，VEGF 過表達(dá)可以阻止細(xì)胞凋亡，這有可能是通過增加軟骨膜血管數(shù)量實(shí)現(xiàn)的[11]。這些研究結(jié)果表明，VEGF 可能是HIF-1 下游的關(guān)鍵靶基因。不同于HIF-1α 的是，HIF-2α 對(duì)生長(zhǎng)板發(fā)育的作用是可有可無的，在肢芽間充質(zhì)細(xì)胞同時(shí)敲除HIF-1α 和HIF-2α 可導(dǎo)致生長(zhǎng)板異常，在僅缺乏HIF-1α 的標(biāo)本中也觀察到相同的現(xiàn)象[12]。

3.HIF對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的調(diào)控

成骨細(xì)胞對(duì)氧濃度有絕對(duì)的要求，氧氣的供應(yīng)可影響成骨型。HIF 的功能與骨生成密切相關(guān)，因?yàn)镠IF 能激活血管生長(zhǎng)因子如VEGF 的表達(dá)。VEGF 活化給成骨細(xì)胞增加了血液供應(yīng)，增加了它們的供氧量。因此，微血管浸潤(rùn)是軟骨內(nèi)成骨和骨膜成骨開始的一個(gè)跡象。在實(shí)驗(yàn)中，0.02%氧濃度被認(rèn)為是缺氧，1%～5%是低氧和18%～21%為常氧。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明HIF 調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)[13]，低氧已被證實(shí)是引發(fā)HIF 調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)的啟動(dòng)因素。除了HIF 以外的其他因素，如薯蕷皂甙元，可以啟動(dòng)一個(gè)與HIF 類似的過程，提高VEGF 基因的表達(dá)，甚至在常氧的條件下。許多實(shí)驗(yàn)支持缺氧條件下VEGF 的表達(dá)主要與HIF-1α 有關(guān)的觀點(diǎn)，也有實(shí)驗(yàn)表明HIF-2α 和VEGF 之間有關(guān)聯(lián)。當(dāng)人骨肉瘤細(xì)胞在24h 1%氧張力的缺氧條件下，VEGF mRNA 水平升高四倍。核提取物免疫印跡顯示HIF-2α 的增加呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，其先于在VEGF mRNA 的表達(dá)出現(xiàn)。在缺氧條件下骨細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)也可上調(diào)，骨細(xì)胞內(nèi)氧的供應(yīng)取決于體液的壓縮力的被動(dòng)擴(kuò)散。急性廢用，消除了壓縮則導(dǎo)致骨細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)上調(diào)[14]。

雖然成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞可能在缺氧的環(huán)境中發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，多數(shù)研究者認(rèn)為缺氧影響成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表型的維持。對(duì)于成骨細(xì)胞，當(dāng)環(huán)境氧濃度從20%降至5%，然后降至2%時(shí)，礦化結(jié)節(jié)可能減少1.7～11 倍。更令人吃驚的是，氧濃度為0.2%可能完全阻止礦化結(jié)節(jié)的形成。胸苷摻入實(shí)驗(yàn)表明，礦化結(jié)節(jié)形成減少是與成骨細(xì)胞增殖率降低相關(guān)[15]。缺氧的環(huán)境也會(huì)影響成骨細(xì)胞的表型，使堿性磷酸酶活性、堿性磷酸酶的mRNA 表達(dá)水平和骨鈣素(OCN)明顯降低。另一方面，脂肪細(xì)胞表型也可以通過缺氧誘導(dǎo)[16]。細(xì)胞外基質(zhì)中缺氧則成骨細(xì)胞產(chǎn)生的膠原組織不良，立即導(dǎo)致骨力學(xué)性能的下降[17]。

細(xì)胞活力檢測(cè)顯示成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2 對(duì)膠原蛋白分泌起著潛在的促進(jìn)作用。缺氧和低氧導(dǎo)致Runx-2 下調(diào)，從而導(dǎo)致Ⅰ型膠原和OCN 的表達(dá)減少。抑制骨形成蛋白-2(BMP-2)也可能有助于Runx-2 的下調(diào)，用重組BMP-2 預(yù)處理成骨細(xì)胞能恢復(fù)缺氧條件下Runx-2 的表達(dá)[18]。這種現(xiàn)象也發(fā)生在其他具有成骨潛能的祖細(xì)胞中，如脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASC)和血管周細(xì)胞。在高壓氧環(huán)境中，HIF-1α 的表達(dá)受到抑制，促進(jìn)成骨，結(jié)節(jié)形成礦化，堿性磷酸酶活性增加。以牽引成骨模型作為例子，當(dāng)22.4Gy 照射了一個(gè)下頜骨骨折，血管生成與對(duì)照相比減少1.7 倍，和成骨作用有顯著相關(guān)性，而高壓氧明顯逆轉(zhuǎn)這種損傷[19]。然而，其他研究表明，這一觀察結(jié)果可能與其他條件有關(guān)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高壓氧在10%胎牛血清(FCS)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而2%FCS 可抑制成骨細(xì)胞增殖[20]。

4.HIF對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控

破骨細(xì)胞是負(fù)責(zé)骨吸收的多核細(xì)胞，來源于循環(huán)系統(tǒng)中單核巨噬細(xì)胞系的造血前體干細(xì)胞，為氧感應(yīng)細(xì)胞。一些腫瘤細(xì)胞(如前列腺癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞與骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞)可以在腫瘤部位造成嚴(yán)重的骨溶解。這個(gè)侵襲現(xiàn)象與HIF-1α 在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)有關(guān)。缺氧是破骨細(xì)胞形成和骨吸收的主要刺激因子。當(dāng)氧張力從正常水平下調(diào)至2%時(shí)，破骨細(xì)胞最多可以傳代21 代。最新研究表明，破骨細(xì)胞的大小由白血病抑制因子(LIF)/LIF 受體信號(hào)和HIF 通路控制。LIF 通過PHD 轉(zhuǎn)錄下調(diào)影響HIF-1α，進(jìn)而增加HIF-1α 的表達(dá)。HIF 也被證明是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的一個(gè)主要因子，并能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[21]。在缺氧情況下，破骨相關(guān)的因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)可引起單核來源的破骨細(xì)胞和巨細(xì)胞瘤細(xì)胞的HIF-1α 的表達(dá)。HIF 下游基因表達(dá)的激活，如Bcl-2，BNIP3，Glut-1 和VEGF。VEGF 會(huì)刺激破骨細(xì)胞。缺氧條件下骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮液能明顯促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。當(dāng)利用小干擾RNA(siRNA)沉默MG-63 的HIF 基因，破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，表明進(jìn)自分泌或旁分泌的VEGF 促進(jìn)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，也解釋了為什么特定的腫瘤可以引起骨溶解[22]。此外，因?yàn)镠IF 是骨橋蛋白(OPN)的上游基因，缺氧的骨細(xì)胞會(huì)增加其OPN 的表達(dá)，OPN 是一種強(qiáng)效破骨細(xì)胞趨化劑，它的表達(dá)會(huì)增加破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和吸附。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧通過HIF-1α/BNIP3 調(diào)控前體破骨細(xì)胞的自噬作用，當(dāng)前體破骨細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)容物發(fā)生降解及結(jié)構(gòu)調(diào)整后即形成破骨細(xì)胞[23]，此外HIF-1α對(duì)軟骨細(xì)胞的存活、增殖、分化和軟骨基質(zhì)的形成也有非常重要的影響[24]。HIF-1α 可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨性細(xì)胞系分化，并且增加ALP 的活性和Ⅰ/Ⅲ型膠原的產(chǎn)生[25]。總之，這些研究結(jié)果表明，缺氧和HIF-1α 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)。

5.結(jié)語

缺氧是人正常發(fā)育的一個(gè)重要的生理因素，并參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，胚胎的發(fā)育、骨缺損的修復(fù)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移，HIF-1α 是目前發(fā)現(xiàn)的缺氧狀態(tài)下發(fā)揮特異性活性的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α 是通過調(diào)節(jié)缺氧基因的表達(dá)來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的氧環(huán)境，同時(shí)，它還參與調(diào)控細(xì)胞分化、血管生成、糖代謝、炎性細(xì)胞及干細(xì)胞歸巢等眾多生理病理反應(yīng)，在決定細(xì)胞命運(yùn)中起著重要的作用。此外，HIF 通路在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的的過程中起著重要的作用，通過激活靶基因調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞增殖、存活、葡萄糖代謝和遷移。

越來越多的證據(jù)表明，HIF 通路中在骨發(fā)育的過程中起著重要的作用。新生血管可以向骨損傷處輸送成骨細(xì)胞和前體破骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞還能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系，血管生成因子可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生成骨性生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞的募集、成骨細(xì)胞的增殖分化及破骨細(xì)胞的活性。此外，HIF 通路已被用來作為一種加速骨損傷后愈合的方法，HIF 通路功能的自分泌或旁分泌的方式直接刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化、增殖、遷移和獨(dú)立的血管生成，從而加速骨礦化。我們需要進(jìn)一步的工作闡明HIF通路與骨發(fā)育之間的關(guān)系，并為加速骨修復(fù)和再生提供新的方法。