原芳芳 王 麗 劉 偉 吳松芳 郭紅延

成體干細(xì)胞是一類位于各種分化組織中的未分化干細(xì)胞，在維持組織的生長和修復(fù)方面具有重要作用。成體干細(xì)胞主要包括造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)兩大類[1]。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)在脂肪組織中含量豐富且易于獲取，已成為基于干細(xì)胞療法(包括骨組織再生)的最具吸引力的干細(xì)胞來源之一[2]。ADSCs 除具有免疫抑制性[3,4]，還具有向成骨、成軟骨以及成脂等多種細(xì)胞譜系的分化潛能。然而，與成骨效果相比，ADSCs 可能更傾向于脂肪形成[5,6]，因此，需要一種新穎的方法引導(dǎo)ADSCs 向成骨譜系分化。

有研究顯示，不同微環(huán)境對干細(xì)胞分化具有不同的調(diào)節(jié)作用[7-9]。近年來研究表明細(xì)胞外基質(zhì)對干細(xì)胞粘附、增殖、分化等多種細(xì)胞活動具有顯著調(diào)節(jié)作用[10]。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞周圍多種大分子組成的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，富含的各種活性分子可以模擬體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境，為細(xì)胞生存及活動提供空間。已有文獻(xiàn)證明BM-dECM 材料對BMSCs 的增殖、成骨以及成軟骨分化具有重要作用[11]，但是該材料對ADSCs 的生物學(xué)影響還未見報道。本實驗擬通過制備BMSCs 衍生的ECM 材料，探究BM-dECM 對ADSCs 增殖和分化能力的影響。

1.材料和方法

1.1 實驗動物及材料 實驗動物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供的SPF 級SD 大鼠[3 周，(300±350)g]、HD-DMEM 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、油紅O 染液、茜素紅染液、細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8) (Dojindo，日本)、TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN，中國)、脫氧核糖核酸酶(DNase)(Sigma，美國)、Fibronectin(ab2413)、Collagen I (ab34710)、Collagen IV(ab6586)抗體(Abcam，英國)、CY3 標(biāo)記羊抗兔IgG(中杉金橋，中國)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(中杉金橋，中國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs 培養(yǎng)及ECM 的制備 取3 周齡SD 大鼠，頸椎脫臼法處死，無菌分離股骨及脛骨，暴露骨髓腔，使用10ml 注射器及23G針頭吸取培養(yǎng)基將骨髓沖出，反復(fù)吹打數(shù)次后1000r/min 離心5 min，棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，每兩天更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2 BM-dECM 的制備 (1)預(yù)處理：將高壓滅菌后的清潔玻璃片放入向培養(yǎng)皿中，加入適量0.1%明膠，37℃靜置1h，吸除明膠，PBS 清洗三次，將BMSCs 接種于培養(yǎng)皿中；

(2)配置溶液：使用PBS 配置50ml 含0.5%Triton X-100、20mM NH4OH 溶液，滅菌后37℃放置備用；

(3)脫細(xì)胞：BMSCs 細(xì)胞培養(yǎng)至第14 天時去除原培養(yǎng)基，加入適量脫細(xì)胞液覆蓋細(xì)胞，作用1～3min，高倍顯微鏡下密切觀察，確認(rèn)脫細(xì)胞核后去除脫細(xì)胞液，加入100U/ml 脫氧核糖核酸酶(DNase)，37℃放置1 小時；吸除脫氧核糖核酸酶，PBS 清洗三次，所得BM-dECM 用PBS 浸泡，置于4℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 H＆E 染色 選取BM-dECM 樣品，使用4%多聚甲醛固定30min，PBS 清洗3 遍，蘇木素染液染色5min，蒸餾水漂洗；1%氨水作用1s，蒸餾水漂洗；1%鹽酸作用5～10s，蒸餾水漂洗；伊紅溶液染色3min，蒸餾水漂洗；樣品經(jīng)梯度酒精(70%～80%～90%～100%)脫水干燥；二甲苯透明10min；封片后光學(xué)顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.2.4 免疫熒光染色 選取BM-dECM 樣品，使用4%多聚甲醛固定30min，PBS 清洗3 遍，羊血清封閉1h，加入 Fibronectin、Collagen I、Collagen IV 抗體(1∶200 比例稀釋)孵育過夜；隨后，PBS 清洗，滴加CY3 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200 比例稀釋)，37℃避光條件下孵育2h，PBS清洗；最后，使用DAPI 復(fù)染，置于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 DNA 含量檢測 (1)DNA 的提取：取接種于6 孔板中未進(jìn)行脫細(xì)胞處理的BMSCs 以及制備完成的BM-dECM 樣品，每組6 個樣本按照TIANamp Genomic DNA Kit 說明操作，所得DNA產(chǎn)物-20℃條件下保存待用；

(2)測試各樣品DNA 含量：調(diào)試Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(Thermo，美國)，依次檢測各樣品DNA 含量；根據(jù)儀器數(shù)據(jù)記錄所得DNA 濃度值以及A260/280 比值。實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 ADSCs 的分離及培養(yǎng) 取3 周齡SD 大鼠，取腹股溝處脂肪組織，將脂肪組織剪碎，加入1ml Ⅳ型膠原酶、1ml dispase 酶、4ml 0.25%胰酶、4ml α-MEM，消化15min 后使用細(xì)胞篩過濾，1000rpm/min 離心5min，用培養(yǎng)基重懸計數(shù)，接種于培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.7 CCK-8 法檢測ADSCs 細(xì)胞增殖 將P3 代ADSCs 按3×103個/孔的密度接種于ECM材料包被的96 孔板(BM-dECM 組)以及普通96 孔板(對照組)中，每組都設(shè)5 復(fù)孔。檢測時每孔加入10μl CCK-8 溶液，作用3 小時后使用酶標(biāo)儀立即測定450nm 處的吸光度值(OD)。實驗重復(fù)3 次。

1.2.8 RT-PCR 檢測 將P3 代ADSCs 按1×105個/孔的密度分別接種于ECM 材料包被的6 孔板(BM-dECM 組)以及普通6 孔板(對照組)中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。分別于3、7、14 天時使用TRIzol reagent 提取各組細(xì)胞總RNA，使用常規(guī)方法檢測RNA 濃度并定量反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。采用SYBR Green RT-PCR 試劑盒檢測2 組ADSCs中成骨相關(guān)基因：特異性AT 富集序列結(jié)合蛋白2(Specific AT enrichment sequence binding protein 2，SATB2)、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)；成脂標(biāo)志基因：成脂過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gama，PPAR-γ)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα)；以及成軟骨相關(guān)基因：聚集蛋白聚糖(Aggrecan，ACAN)、Ⅱ型膠原蛋白-A1(Type II collagen-A1，COL2A1)、性別決定相關(guān)基因SOX9 (SRY-related high mobility group-box gene 9，SOX9)mRNA 的表達(dá)情況。每個樣本中設(shè)置3 個復(fù)孔同時進(jìn)行，并重復(fù)實驗3 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，各基因的相對表達(dá)量以在對照組中ADSCs 測得的表達(dá)量作為基準(zhǔn)量1 進(jìn)行比較得到相對定量結(jié)果。各引物序列見表1。

本研究采用matK、psbA-trnH、psbK-psbI和rbcL 4個DNA候選條形碼序列，對蜘蛛抱蛋屬19種104批樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增成功率、測序效率、種內(nèi)與種間變異水平和鑒定成功率等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，擬獲得該屬植物物種鑒定的最佳DNA條形碼序列，以期為該屬物種的分子分類學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.9 統(tǒng)計分析 本實驗所有數(shù)據(jù)分析和圖表制作均使用GraphPad Prism 7.0 完成。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，采用t 檢驗進(jìn)行分析，α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 BM-dECM 的表征

2.1.1 H＆E 染色結(jié)果 對BM-dECM 材料進(jìn)行H＆E 染色結(jié)果顯示，BM-dECM 材料結(jié)構(gòu)良好，藍(lán)紫色的細(xì)胞核已經(jīng)被大部分脫除，粉色的細(xì)胞外基質(zhì)成分得以保留(圖1)。通過此種脫細(xì)胞方法處理所得的BM-dECM 呈一層均勻且致密的形貌，保持了連續(xù)的膜狀形態(tài)。

圖1 H＆E 染色結(jié)果

2.1.2 免疫熒光染色結(jié)果 使用Fibronectin、Collagen I、Collagen IV 抗體對BM-dECM 材料進(jìn)行免疫熒光染色，BM-dECM 材料中纖連蛋白和膠原纖維結(jié)構(gòu)清晰可見(圖2)，證明所制備的BM-dECM 很好地保留了BMSCs 分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維蛋白和蛋白多糖等成分，可以仿生細(xì)胞生長的微環(huán)境，為其作為支架材料用于細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造了條件。

圖2 BM-dECM 材料免疫熒光染色結(jié)果

2.1.3 DNA 定量檢測結(jié)果 DNA 定量檢測結(jié)果顯示未進(jìn)行脫細(xì)胞處理的細(xì)胞片中DNA 含量為73.96±10.20 ng/μl，脫細(xì)胞后BM-dECM 材料中DNA 的量下降為17.72±3.24 ng/μl，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)，極大的降低了BM-dECM材料的免疫原性。結(jié)合H＆E 染色結(jié)果證實脫細(xì)胞處理后細(xì)胞核成分被大部分脫去，可以證明BM-dECM 材料滿足細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備要求[12]，為后續(xù)實驗操作提供了可能。

圖3 BMSCs 細(xì)胞與BM-dECM 材料DNA 含量檢測結(jié)果

2.2 ADSCs 增殖的檢測 CCK-8 檢測結(jié)果顯示：BM-dECM 組和對照組中ADSCs 細(xì)胞數(shù)量都隨著時間增加而呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。第1 天時兩組間OD 值沒有差異(P＞0.05)；隨后3、5、7 天均檢測到BM-dECM 組的OD 值要高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。結(jié)果表明BMdECM 材料能促進(jìn)ADSCs 細(xì)胞體外增殖。

圖4 兩組ADSCs 增殖曲線

2.3 ADSCs 分化的檢測

2.3.1 成脂相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果顯示總體趨勢對照組PPAR-γ、C/EBPα 基因表達(dá)量隨時間增加逐漸升高，而ECM 組兩基因表達(dá)量隨時間增加呈下降趨勢。PPAR-γ、C/EBPα 基因在兩組細(xì)胞各個時間點的表達(dá)量具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。提示ADSCs 具有自發(fā)向成脂分化的潛力，而BM-dECM 材料對ADSCs 脂肪分化的能力具有一定抑制作用。

2.3.2 成骨相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果顯示總體趨勢對照組STAB2、OCN、RUNX2 基因表達(dá)量均隨時間增加而降低；ECM 組STAB2、OCN基因表達(dá)量隨時間增加逐漸升高，RUNX2 的表達(dá)量呈現(xiàn)3～7 天先上升而后7～14 天逐漸下降的趨勢；除STAB2 基因3、7 天時表達(dá)量高于ECM 組外，其余各基因在其他時間點均為ECM 組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖6)，提示與對照組相比BM-dECM 材料在一定程度上促進(jìn)了ADSCs 向成骨分化。

2.3.3 成軟骨相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果顯示 總體趨勢雖然兩組細(xì)胞COL2A1、SOX9、ACAN 基因表達(dá)量均隨時間增加而降低，但是，除COL2A1 基因在3～7 天時對照組表達(dá)量高于ECM 組外，其余時間點均為ECM 組各個基因表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖7)。提示雖然與對照組相比BM-dECM 在維持ADSCs成軟骨分化能力方面具有一定的潛能，但隨時間變化BM-dECM 對ADSCs 的成軟骨能力仍具有一定的抑制作用。

圖5 兩組ADSCs 不同時間點成脂相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果

圖6 兩組ADSCs 不同時間點成骨相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果

圖7 兩組ADSCs 不同時間點成軟骨相關(guān)基因RT-PCR 檢測結(jié)果

3.討論

ADSCs 由于其具有多向分化潛能、免疫調(diào)控、可自我復(fù)制和可自體移植等優(yōu)點，越來越受到學(xué)者們的青睞。然而與BMSCs 相比，ADSCs 的成骨分化能力較弱[13]，并且體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易喪失干細(xì)胞性能，如何促進(jìn)ADSCs 的增殖并增強其向成骨方向分化的潛能一直是組織工程領(lǐng)域研究的熱點之一。

近年來研究者們發(fā)現(xiàn)ECM 材料對干細(xì)胞的增殖維持具有積極作用[14]。本實驗的檢測結(jié)果顯示在BM-dECM 上培養(yǎng)的ADSCs 相比對照組具有更強的增殖能力，說明該材料具有良好的生物相容性。ECM 促進(jìn)細(xì)胞增殖的原因主要有以下兩點：首先，ECM 的3-D 空間結(jié)構(gòu)和物理特性可以模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成微環(huán)境的功能，即為細(xì)胞與細(xì)胞以及與微環(huán)境間的信息交流提供了途徑，為營養(yǎng)物質(zhì)的傳送提供了輸送通道[15-17]；其次，ECM 是富含各類蛋白聚糖的材料，其纖維結(jié)構(gòu)能夠可逆地結(jié)合生長因子和細(xì)胞因子，這些活性成分在組織周圍的信號通路中發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞的分裂遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14,18]。

Ragelle 等研究者發(fā)現(xiàn)BM-dECM 的成分與骨髓中的ECM 幾乎相同[19]，可以精確模擬骨組織中各成分的組成與含量。近年來許多研究結(jié)果顯示：與在TCP 上培養(yǎng)的BMSCs 相比，在BM-dECM上培養(yǎng)BMSCs 可提高其增殖速率和能力[20]，保留干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，提高成骨分化潛能[21]，降低細(xì)胞衰老，并降低細(xì)胞內(nèi)ROS 活性[22]，證明BMdECM 材料具有很好的仿生性及生物活性。本實驗結(jié)果顯示BM-dECM 材料同樣可以促進(jìn)ADSCs自發(fā)向成骨分化的潛能，其潛在原因可能是BMdECM 中的某些蛋白物質(zhì)或者促成骨因子改善了ADSCs 的成骨微環(huán)境，從而顯著促進(jìn)ADSCs 的成骨分化，但本實驗對其分化調(diào)節(jié)作用的具體機制沒有作深入探討，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，BM-dECM 材料可以顯著提高ADSCs 的體外增殖能力；通過對成脂、成骨、成軟骨相關(guān)的標(biāo)志基因的RT-PCR 檢測進(jìn)一步證實BM-dECM 材料抑制了ADSCs 成脂成軟骨的分化能力，提高了ADSCs 的成骨潛能。本實驗提示可以通過構(gòu)建ECM 材料模擬微環(huán)境，來提高的ADSCs 增殖及成骨分化能力，為今后臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。