陳前智,沈娜,李雪芹

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科,武漢 430022)

結(jié)腸癌是一種在結(jié)腸組織中形成惡性腫瘤的消化道疾病,是發(fā)病率排名第三的癌癥,也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1-2]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化,中國已成為結(jié)腸癌全球每年新增病例和死亡例數(shù)最多的國家,我國居民的健康因此受到嚴(yán)重威脅[3]。盡管外科治療、化學(xué)治療、放射治療和靶向治療發(fā)展迅速,但晚期結(jié)腸癌患者5年生存率仍未見明顯改善,預(yù)后較差[2,4]。因此,深入探索結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控靶點(diǎn),對(duì)改善結(jié)腸癌患者治療策略具有重大的臨床意義。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2(serine hydroxymethyltransferase 2,SHMT2)作為絲氨酸代謝的關(guān)鍵酶,是近年來研究熱點(diǎn),在多種惡性腫瘤中的作用已被陸續(xù)揭示[5]。但SHMT2在結(jié)腸癌中作用和調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究擬驗(yàn)證SHMT2在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的相關(guān)性,進(jìn)而以探索SHMT2調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制為研究目標(biāo),發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌增殖相關(guān)的調(diào)控機(jī)制和分子靶點(diǎn),為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要細(xì)胞和試劑 HCT116、LoVo、HEK293T是實(shí)驗(yàn)室既往凍存的細(xì)胞株,源于ATCC細(xì)胞庫。高糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國Gibco公司。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑、NP40細(xì)胞裂解液來源于武漢啟動(dòng)子公司;轉(zhuǎn)染試劑TurboFect、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液購于美國Thermo Fisher公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、SHMT2抗體、SQSTM1抗體均來源于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;低表達(dá)質(zhì)粒(shSHMT2#1和#2)和高表達(dá)質(zhì)粒(Flag-SQSTM1)均購自吉?jiǎng)P基因公司;SHIN1(貨號(hào):RZ-2994)購于美國MCE公司。

1.2細(xì)胞的分組和實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞是以轉(zhuǎn)染不同質(zhì)?；蚣尤氩煌深A(yù)因素為分組條件,如shNC或vector組轉(zhuǎn)染對(duì)照空載質(zhì)粒,shSHMT2組轉(zhuǎn)染shSHMT2干擾質(zhì)粒,Flag-SHMT2組轉(zhuǎn)染SHMT2過表達(dá)質(zhì)粒(6孔板里單孔加質(zhì)粒2 μg),SHIN1組加入終濃度為10 nmol·L-1抑制劑SHIN1。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間均為48 h,轉(zhuǎn)染完成后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3免疫組化染色實(shí)驗(yàn) 結(jié)腸癌及癌旁組織手術(shù)標(biāo)本來自于武漢協(xié)和醫(yī)院病理科,隨機(jī)選取20對(duì),其臨床分期為Ⅰ—Ⅲ期,取材日期為2021—2022年。用40%甲醛溶液固定組織標(biāo)本,然后用石蠟進(jìn)行包埋,將石蠟組織切成厚度4 mm的切片。免疫組化染色檢測(cè)SHMT2蛋白表達(dá)。SHMT2蛋白主要染色于細(xì)胞質(zhì),部分染色于細(xì)胞核。蛋白表達(dá)水平通過陽性比例評(píng)分與強(qiáng)度評(píng)分相乘計(jì)算染色指標(biāo),其中比例評(píng)分為顯示陽性染色細(xì)胞的比例(0:<10%;1:10%～30%;2:31%～70%;3:>70%),強(qiáng)度評(píng)分是染色強(qiáng)度的評(píng)分(0:無染色;1:弱染色;2:中等染色;3:強(qiáng)染色)。

1.4數(shù)據(jù)庫篩選及數(shù)據(jù)處理 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理TCGA-COAD(結(jié)腸腺癌)項(xiàng)目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù),并提取TPM格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(運(yùn)用R語言stats包以及car包),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化(ggplot2包),分析不同組織蛋白表達(dá)的差異水平。統(tǒng)計(jì)方法: Wilcoxon rank sum test。使用R語言的survival包進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)檢驗(yàn)并進(jìn)行擬合生存回歸,結(jié)果用survminer包及ggplot2包進(jìn)行可視化,分析不同蛋白表達(dá)的生存預(yù)后情況。采用Logrank檢驗(yàn)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),孵育于含5%二氧化碳(CO2)的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),可用含EDTA的胰酶進(jìn)行消化傳代。在HCT116細(xì)胞中用TurboFect試劑轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒,孵育36～48 h后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.6細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將預(yù)處理細(xì)胞消化后,用完全培養(yǎng)基重懸,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞約500個(gè)加入6孔板中,補(bǔ)足含血清的培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)10～14 d,中間每隔2～3 d換液一次。待細(xì)胞克隆數(shù)足夠后中止實(shí)驗(yàn),用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,龍膽紫進(jìn)行染色。洗滌充分后進(jìn)行攝像,計(jì)算單孔內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù)目,重復(fù)3次,取平均值。

1.7蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)檢測(cè)蛋白 在冰上用NP40將處理的細(xì)胞裂解15 min。將裂解產(chǎn)物在12 000 r·min-1,4 ℃,離心10 min,并使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)量上清液的蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。將PVDF膜與特定抗體孵育,并用化學(xué)發(fā)光溶液進(jìn)行檢測(cè)。

1.8蛋白質(zhì)免疫共沉淀 將HEK293T全細(xì)胞裂解液與特異性抗體孵育過夜,然后在4 ℃添加蛋白A/G珠,旋轉(zhuǎn)2～4 h。用NP40溶液洗滌3次,與SDS樣品緩沖液混合。蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證不同蛋白的結(jié)合關(guān)系。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SHMT2在結(jié)腸癌組織的表達(dá) 結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示SHMT2在癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁對(duì)照組織。

①與癌旁組織比較,t=11.93,P<0.01。

2.2SHMT2高表達(dá)與結(jié)腸癌不良預(yù)后相關(guān)性 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)腸腺癌的癌組織中SHMT2的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(圖2A)。相關(guān)預(yù)后分析發(fā)現(xiàn),SHMT2高表達(dá)組5年疾病特異性生存率顯著低于SHMT2低表達(dá)組(圖2B)。說明SHMT2高表達(dá)與結(jié)腸癌的不良預(yù)后密切相關(guān),提示其可能起到致癌作用。

①與正常組織比較,P<0.01;②與SHMT2高表達(dá)組比較,P<0.05。

2.3低表達(dá)SHMT2或SHMT2抑制劑(SHIN1)對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的抑制作用 在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC或shSHMT2質(zhì)粒,用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Western blotting結(jié)果顯示,在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shSHMT2質(zhì)粒后,SHMT2蛋白被顯著下調(diào),低表達(dá)SHMT2可顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖能力。為了驗(yàn)證SHIN1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的具體作用,將HCT116細(xì)胞分為NC對(duì)照組和SHIN1抑制劑組。根據(jù)SHIN1抑制劑說明書及相關(guān)參考文獻(xiàn),將其作用終濃度選擇為10 nmol·L-1。將細(xì)胞處理后進(jìn)行細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SHMT2抑制劑也可明顯抑制HCT116細(xì)胞增殖,見圖3。

①與shNC空白組比較,t=4.651,P=0.0097;②與NC空白組比較,t=6.413,P=0.003。

2.4SHIN1對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 Western blotting結(jié)果顯示,在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-SHMT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,SHMT2成功過表達(dá)(圖4A)。與vector對(duì)照組比較,過表達(dá)SHMT2組增殖水平顯著升高,而加入SHIN1可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)SHMT2對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,見圖4B和C。

①與vector空載對(duì)照組對(duì)比,t=6.172,P=0.003 5;②與Flag-SHMT2過表達(dá)組比較,t=6.405,P=0.003 1。

2.5SHMT2對(duì)SQSTM1蛋白調(diào)控作用 在HCT116及LoVo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC對(duì)照質(zhì)粒、shSHMT2#1或shSHMT2#2干擾質(zhì)粒,通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SHMT2可下調(diào)SQSTM1的蛋白水平(圖5A)。在293T細(xì)胞中,通過蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHMT2可結(jié)合SQSTM1蛋白(圖5B)。說明SHMT2能夠與SQSTM1蛋白結(jié)合并調(diào)控其蛋白水平。

圖5 SHMT2蛋白結(jié)合并調(diào)控SQSTM1蛋白水平

2.6SHMT2促進(jìn)HCT116細(xì)胞增殖依賴于SQSTM1為了進(jìn)一步驗(yàn)證SHMT2調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖是否依賴于SQSTM1通路,本研究設(shè)計(jì)了相關(guān)逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。將HCT116細(xì)胞分為三組,即shNC對(duì)照組、shSHMT2低表達(dá)組、shSHMT2+Flag-SQSTM1回復(fù)組,轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后,通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低表達(dá)SHMT2對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用可被高表達(dá)SQSTM1所逆轉(zhuǎn)(圖6A和B)。說明SHMT2對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用依賴于SQSTM1蛋白。

①與shNC對(duì)照組對(duì)比,t=4.986,P=0.0076;②與shSHMT2低表達(dá)組對(duì)比,t=7.291,P=0.001 9。

3 討論

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)的一種常見惡性腫瘤,在男性和女性癌癥發(fā)病率中分別是第三和第二常見[2]。盡管在過去的幾十年里,其總體發(fā)病率和病死率顯著下降,但晚期結(jié)腸癌患者總體生存率仍然很差。因此,亟需進(jìn)一步研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

SHMT2是一種磷酸吡哆醛依賴性四聚體酶,可催化絲氨酸向甘氨酸的可逆轉(zhuǎn)變,從而促進(jìn)一碳單位的產(chǎn)生,而一碳單位對(duì)于細(xì)胞生長以及氧化還原和表觀遺傳狀態(tài)的調(diào)節(jié)是必不可少的[6]。絲氨酸和甘氨酸是一碳單位主要來源,對(duì)細(xì)胞增殖至關(guān)重要[7]。在低氧環(huán)境下,SHMT2可以上調(diào)并促進(jìn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和谷胱甘肽的生成,以維持氧化還原平衡[8]。越來越多的證據(jù)表明,SHMT2促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長,并與不良預(yù)后密切相關(guān)[6,9]。但SHMT2對(duì)結(jié)腸癌增殖的調(diào)控及其具體分子機(jī)制并不清楚。

在本研究中,通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SHMT2在結(jié)腸癌癌組織中蛋白水平顯著高于相應(yīng)的癌旁組織,而且SHMT2高表達(dá)與結(jié)腸癌的不良預(yù)后相關(guān),進(jìn)而通過相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHMT2在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,驗(yàn)證SHMT2抑制劑也可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證SHMT2和SQSTM1可以相互結(jié)合,而且通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SHMT2可下調(diào)SQSTM1蛋白的表達(dá)水平。SQSTM1是一種自噬的銜接蛋白,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。此外,它通過與Keap1、TRAF6、IKK2/β等關(guān)鍵信號(hào)蛋白相互作用來激活包括Nrf2、mTORC1和NF-κB在內(nèi)的許多信號(hào)通路[10]。SQSTM1在肝細(xì)胞癌和乳腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào),與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)[11]。SQSTM1在多種癌癥中被認(rèn)為是一種新的癌蛋白,具有激活多種致癌信號(hào)通路的潛力[12]。自噬受阻可導(dǎo)致p62高表達(dá),與不良臨床預(yù)后相關(guān)[12]。在細(xì)胞系HCT116中敲低SHMT2同時(shí)高表達(dá)SQSTM1,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SQSTM1可逆轉(zhuǎn)敲低SHMT2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。從而驗(yàn)證SHMT2可通過結(jié)合并上調(diào)SQSTM1表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

本研究通過生信分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHMT2是結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子,并發(fā)現(xiàn)SHMT2-SQSTM1信號(hào)軸在相關(guān)調(diào)控中的重要作用,探索了SHMT2抑制劑對(duì)結(jié)腸癌治療的潛在應(yīng)用前景,為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究提供新的線索和思路,為其臨床治療提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。