王希佳，程佳芬

上海市第十人民醫(yī)院1 臨床藥學(xué)科；2 腎臟風(fēng)濕科，上海 200072

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫疾病；高發(fā)于30～50 歲女性，全球發(fā)病率為0.5%～1%[1]。目前在常用的抗風(fēng)濕類藥物中，TNF 抑制劑由于較好的療效和安全性受到廣泛關(guān)注，其中，依那西普是中國(guó)治療RA 最常用的TNF 抑制劑[2]。盡管依那西普的單用或聯(lián)用在大多數(shù)RA 患者中效果顯著，但仍有部分患者對(duì)于依那西普缺乏應(yīng)答[3]。另外，依那西普的藥物成本較高，患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大。因此，亟待探索影響依那西普治療RA 療效的因素，以期提高療效并進(jìn)行個(gè)體化治療，從而減輕患者負(fù)擔(dān)。

14-3-3 蛋白是由不同基因編碼的、以穩(wěn)定的同源/異源二聚體形式結(jié)合的、高度保守的酸性蛋白家族，通過(guò)控制蛋白在不同信號(hào)通路中的活性來(lái)調(diào)控各種生理和病理過(guò)程，包括自身免疫性疾病，如RA、多發(fā)性硬化癥等[4，5]。作為7 種不同的亞型的一種，14-3-3η 蛋白可以增加促炎信號(hào)傳導(dǎo)以及炎性介質(zhì)，并與RA 患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)；然而，其與依那西普治療RA 患者的臨床療效的關(guān)聯(lián)尚不明確[6]。因此，本研究旨在評(píng)估14-3-3η 表達(dá)水平與RA 患病風(fēng)險(xiǎn)、疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)，并且探索其在依那西普治療RA 患者臨床應(yīng)答中的預(yù)測(cè)作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究納入2014 年7 月至2017 年6 月在本院接受依那西普治療的88 例活動(dòng)性RA 患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)類風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987 年修訂的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)；②年齡滿18 周歲；③中重度疾病活動(dòng)度，定義為基于紅細(xì)胞沉降率的28 關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分 〔28-joint disease activity score based on erythrocyte sedimentation rate，DAS28（ESR）〕≥3.2；④自愿接受依那西普聯(lián)合甲氨蝶呤（MTX）或來(lái)氟米特（LEF）治療24 周；⑤經(jīng)研究者評(píng)估可定期隨訪。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有依那西普禁忌癥者；②曾經(jīng)或正患有除RA 以外的炎癥性關(guān)節(jié)炎，如痛風(fēng)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病等；③合并除RA 以外的其他自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、混合性結(jié)締組織病、硬皮病、結(jié)核病、多肌炎等；④伴有活動(dòng)性或復(fù)發(fā)性的細(xì)菌、病毒、真菌、分支桿菌感染病史的患者；⑤伴有惡性疾病，如血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤等；⑥孕婦或哺乳期婦女。

入組RA 患者平均年齡為57.7±11.3 歲，男性16 例（18.2%）、女性72 例（81.8%）；平均身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為22.1±3.4 kg·m-2；中位病程為3.3 年（四分位值：1.5～6.9 年）；類風(fēng)濕因子（RF）陽(yáng)性者59 例（67.0%），抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（ACCP）陽(yáng)性者60 例（68.2%）；有生物制劑治療史者14 例（15.9%）；壓痛關(guān)節(jié)數(shù)（TJC）為7.3±3.4，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（SJC）為6.7±3.5；紅細(xì)胞沉降率（ESR）為（46.3±26.4）mm·h-1；C反應(yīng)蛋白（CRP）為（45.3±37.4）mg·L-1；DAS28（ESR）評(píng)分為5.3±0.7；健康評(píng)估問(wèn)卷殘疾指數(shù)評(píng)分（HAQDI）為1.8±0.3。

此外，研究同期納入80 例在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的志愿者作為對(duì)照。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集

治療前采集所有RA 患者的全血樣本。采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管，混合4～5 次，直立置于室溫、待血液完全凝固（約1 h），1600 g 離心10 min，分離血清。將分離好的血清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的凍存管中，按照每管400～500 μL 分裝好，置于-80 ℃保存待測(cè)。

健康對(duì)照者的全血樣本采集、處理同RA 患者。

1.3 血清中14-3-3η 蛋白檢測(cè)

采用定制的14-3-3η 蛋白ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）檢測(cè)受試者血清中14-3-3η蛋白水平，所有操作過(guò)程均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 治療

RA 患者依據(jù)病情及意愿，選擇接受依那西普聯(lián)合MTX 或依那西普聯(lián)合LEF。45 例選擇依那西普聯(lián)合MTX，用藥方案如下：依那西普25 mg/次，每周2 次，肌肉皮下注射；MTX 7.5～20 mg/周，口服，持續(xù)24 周。43 例選擇依那西普聯(lián)合LEF，用藥方案如下：依那西普25 mg/次，每周2 次，肌肉皮下注射；LEF 20 mg/天，口服，持續(xù)24 周。

1.5 治療應(yīng)答評(píng)估

分別于治療前和治療24 周后評(píng)估所有RA 患者DAS28（ESR）評(píng)分。參考?xì)W洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）標(biāo)準(zhǔn)，臨床應(yīng)答定義為相比治療前，治療后DAS28（ESR）評(píng)分下降≥1.2 分。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24.0（IBM，美國(guó)）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用GraphPad prism V7.01 進(jìn)行繪圖。變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）、中位值（25th～75th 分位值）或頻次（%）的形式描述。組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。連續(xù)變量間的關(guān)聯(lián)采用Spearman 相關(guān)性分析。血清14-3-3η 水平對(duì)于RA 患者的診斷作用以及對(duì)于臨床應(yīng)答和不應(yīng)答患者的區(qū)分作用采用受試者工作特征曲線（ROC）、曲線下面積（AUC）以及AUC 95%置信區(qū)間（CI）進(jìn)行評(píng)估。臨床應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素采用單元和多元邏輯回歸模型（向前選擇法）進(jìn)行分析，并計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%CI。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 14-3-3η 在RA 患者和健康對(duì)照者中表達(dá)水平

14-3-3η 在RA 患者中表達(dá)量為1.41（0.09～7.24）ng·mL-1，顯著高于其在健康對(duì)照者中表達(dá)量〔0.04（0.02～0.08）ng·mL-1〕（P＜0.001）。見(jiàn)圖1-A。14-3-3η 區(qū)分RA 患者與健康對(duì)照者的ROC 曲線下面積AUC 為0.868（95%CI：0.815～0.921），表明血清14-3-3η 水平對(duì)于分辨RA 患者與健康對(duì)照者有很好的區(qū)分作用。見(jiàn)圖1-B。

圖1 RA 患者和健康對(duì)照者中14-3-3η 表達(dá)差異以及ROC 曲線

2.2 14-3-3η 表達(dá)量與臨床特征的關(guān)聯(lián)分析

14-3-3η 與呈連續(xù)變量的臨床特征關(guān)聯(lián)分析顯示：14-3-3η 表達(dá)量與RA 患者病程（P=0.028）、SJC（P=0.003）、CRP（P＜0.001）水平以及DAS28（ESR）評(píng)分（P=0.012）呈正相關(guān)，見(jiàn)表1；而與患者年齡（P=0.529）、BMI（P=0.829）、TJC（P=0.730）、ESR（P=0.056）、HAQ-DI 評(píng)分（P=0.172）無(wú)關(guān)聯(lián)。

此外，14-3-3η 與呈分類變量的臨床特征關(guān)聯(lián)分析顯示：14-3-3η 表達(dá)量（中位值）與ACCP 陽(yáng)性正相關(guān)（P=0.025）；而與RA 患者性別（P=0.762）、RF狀態(tài)（P=0.065）、生物制劑治療史（P=0.083）無(wú)關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表2。

表1 14-3-3η表達(dá)量與臨床特征（連續(xù)變量）關(guān)聯(lián)

表2 14-3-3η 表達(dá)量與臨床特征（分類變量）關(guān)聯(lián)

2.3 14-3-3η 與臨床應(yīng)答的關(guān)聯(lián)分析

在接受依那西普治療的RA 患者中，58 例達(dá)到臨床應(yīng)答，30 例未達(dá)到臨床應(yīng)答。臨床應(yīng)答患者基線期14-3-3η 表達(dá)量為4.59（0.14～8.94）ng·mL-1，高于臨床無(wú)應(yīng)答患者基線期14-3-3η 表達(dá)量〔0.70（0.05～3.12）ng·mL-1〕（P=0.011）。見(jiàn)圖2-A。表明14-3-3η 高水平與依那西普治療RA 患者高臨床應(yīng)答相關(guān)。

進(jìn)一步ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，14-3-3η 區(qū)分臨床應(yīng)答患者與無(wú)應(yīng)答患者的AUC 為0.665（95%CI：0.547～0.784），表明14-3-3η 可以在一定程度上預(yù)測(cè)依那西普治療RA 患者的臨床應(yīng)答。見(jiàn)圖2-B。

2.4 臨床應(yīng)答預(yù)測(cè)因素的單元與多元邏輯回歸分析

圖2 臨床應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答患者血清中14-3-3η 表達(dá)水平差異以及ROC 曲線

針對(duì)臨床應(yīng)答預(yù)測(cè)因素的單元邏輯回歸結(jié)果顯示，14-3-3η 表達(dá)量〔P=0.021，OR=1.141（1.020～1.277）〕、ACCP 陽(yáng)性 〔P=0.006，OR=6.187（1.670～22.919）〕和CRP 水平〔P=0.044，OR=1.015（1.000～1.030）〕可預(yù)測(cè)更高的臨床應(yīng)答。見(jiàn)表3。

表3 臨床應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素-單元邏輯回歸

多元邏輯回歸結(jié)果顯示，CRP 〔P=0.047，OR=1.128（1.110～1.145）〕和ACCP 陽(yáng)性〔P=0.022，OR=5.185（1.275～21.090）〕可以獨(dú)立預(yù)測(cè)更高的臨床應(yīng)答；而14-3-3η 表達(dá)量并不是臨床應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。見(jiàn)表4。

表4 臨床應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素-多元邏輯回歸

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：（1）14-3-3η 在RA 患者血清中高表達(dá)，進(jìn)一步ROC 曲線分析顯示，14-3-3η 可以預(yù)測(cè)RA 高患病風(fēng)險(xiǎn)，且其與RA 患者疾病活動(dòng)度正相關(guān)。（2）14-3-3η 在臨床應(yīng)答患者中高表達(dá)，且ROC 曲線分析表明14-3-3η 可以預(yù)測(cè)依那西普治療RA 患者更高的臨床應(yīng)答。

14-3-3η 是一種在真核生物中廣泛表達(dá)的高度保守的酸性蛋白，能夠參與信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理學(xué)進(jìn)程[7，8]。在RA 研究中，RA 患者血清14-3-3η 表達(dá)量較健康對(duì)照者更高，且14-3-3η 高表達(dá)的RA 患者疾病活動(dòng)度普遍較14-3-3η 低表達(dá)患者更高[9]。

另一項(xiàng)研究表明，14-3-3η 濃度在RA 患者血清中明顯升高，提高了炎癥因子如白介素-1 與白介素-6 的水平，并與類風(fēng)濕因子、ACCP 水平呈正相關(guān)[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3η 在炎性關(guān)節(jié)疾病患者滑膜液和血清中高表達(dá)，且其表達(dá)量與已知的RA標(biāo)記物基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-1、MMP-3 正相關(guān)[4]。以上研究表明，14-3-3η 在RA 患者中高表達(dá)，且與RA 患病風(fēng)險(xiǎn)、炎癥水平、疾病活動(dòng)度正相關(guān)；但這些研究均基于歐洲與北美的RA 患者，而在中國(guó)RA 患者中14-3-3η 與RA 患病風(fēng)險(xiǎn)、疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)少有研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)RA 患者中，14-3-3η 高表達(dá)可以預(yù)測(cè)RA 高患病風(fēng)險(xiǎn)，且與RA 病程、SJC、CRP 水平、ACCP 陽(yáng)性以及DAS28（ESR）評(píng)分正相關(guān)。可能的原因是：（1）14-3-3η 能夠推進(jìn)促炎信號(hào)的傳導(dǎo)，如MAPK 信號(hào)通路，以及炎性介質(zhì)的釋放，如白介素-1、白介素-6 等，使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而加重了患者疾病活動(dòng)度。（2）14-3-3η 可能通過(guò)抑制軟骨分化，增加軟骨侵蝕來(lái)促進(jìn)RA 患者骨損傷，從而增加了受累的關(guān)節(jié)數(shù)[11]。（3）由于14-3-3η 水平與RA骨侵蝕程度呈正相關(guān)，而RA 病程與骨侵蝕程度也呈正相關(guān)，因此14-3-3η 水平與RA 病程呈正相關(guān)[11]。

有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3η 不僅在RA 患者中差異表達(dá)，還可以預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的應(yīng)答。在接受傳統(tǒng)DMARD 治療的RA 患者中，14-3-3η 基線期表達(dá)量與患者治療一年后臨床緩解率〔DAS28（ESR）≤2.6 分〕呈負(fù)相關(guān)[12]。同樣，在接受托珠單抗（tocilizumab）治療的RA 患者中，治療前14-3-3η表達(dá)量越低，患者治療12 周后臨床緩解率〔DAS28（ESR）≤2.6 分〕更高[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在接受依那西普治療的RA 患者中，基線14-3-3η 水平在應(yīng)答患者中較無(wú)應(yīng)答患者中更高。這可能歸因于：

（1）本研究與之前研究的終點(diǎn)不同。在既往研究中，研究終點(diǎn)為臨床緩解，即DAS28（ESR）≤2.6分。已知14-3-3η 表達(dá)量與RA 疾病活動(dòng)度正相關(guān)，由此得出：基線期14-3-3η 表達(dá)量越低，患者疾病活動(dòng)度更低，DAS28（ESR）評(píng)分也更低。因此，患者在治療后更易達(dá)到DAS28（ESR）≤2.6 分。而本研究中，臨床應(yīng)答定義為相比治療前，治療后DAS28（ESR）評(píng)分下降≥1.2 分。基線14-3-3η 水平越高的患者疾病活動(dòng)度越高〔DAS28（ESR）評(píng)分越高〕，接受治療后DAS28（ESR）評(píng)分下降可能越大，故而基線14-3-3η 水平越高的患者對(duì)于治療的應(yīng)答更高。

（2）14-3-3η 與患者炎癥水平正相關(guān)，而TNF抑制劑具有抗炎作用，因此，基線期14-3-3η 水平越高的RA 患者對(duì)于TNF 抑制劑抗炎作用的反應(yīng)可能更高，炎癥水平下降幅度更大，DAS28（ESR）評(píng)分降低值更多。

此外還發(fā)現(xiàn)，14-3-3η 可以預(yù)測(cè)，但不能獨(dú)立預(yù)測(cè)更高的臨床應(yīng)答，這可能由于14-3-3η 能夠通過(guò)影響其它獨(dú)立影響因素，如CRP、ACCP 等，從而間接地影響RA 患者對(duì)于依那西普治療的應(yīng)答。

本研究初步揭示了14-3-3η 與RA 患者對(duì)于依那西普治療應(yīng)答的關(guān)聯(lián)，但仍存在一些缺陷：（1）雖然本研究的樣本量對(duì)比于大多數(shù)其它研究而言較大，但是深入的研究仍需要擴(kuò)大樣本量來(lái)提高統(tǒng)計(jì)效能。（2）14-3-3η 在RA 中的分子機(jī)制并沒(méi)有納入研究。（3）已知14-3-3η 具有一定的炎癥區(qū)域特異性，關(guān)節(jié)滑膜液測(cè)定14-3-3η 可能與血清中得出的結(jié)果有異，因此，本研究的結(jié)果需要在不同的樣本中作進(jìn)一步驗(yàn)證[7]。（4）2009/2010 年，ACR/EULAR 已經(jīng)提出了RA 的新的分類標(biāo)準(zhǔn)，然而本研究使用的仍為1987 年的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)，未使用更新版本。

綜上所述，血清14-3-3η 水平與RA 高患病風(fēng)險(xiǎn)及疾病活動(dòng)度相關(guān)，并可以在一定程度上預(yù)測(cè)RA 患者對(duì)依那西普治療的臨床應(yīng)答。