陳如萍，劉蕊

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率分別位于全球癌癥第 3 位和第 2 位［1］。我國 CRC 患者亦呈逐年上升趨勢。腸鏡檢查是腸道腫瘤最有效的篩查方式，但由于我國腸鏡篩查還不夠普及，CRC 早期確診病例占比低，不能及時發(fā)現(xiàn)并干預(yù)，導(dǎo)致5年生存率低于發(fā)達(dá)國家。如今，臨床對更具優(yōu)勢的遺傳學(xué)篩查和檢測技術(shù)的需求日益增長。下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)是大規(guī)模平行測序技術(shù)的總稱，其檢測通量高、速度快、準(zhǔn)確度高且信息量豐富［2］。大規(guī)模的基因組測序提高了人們對核酸功能的理解，利用NGS 鑒定大量突變位點(diǎn)更加切合實(shí)際［3］。因此，NGS 用于CRC 的篩查、診斷、治療及預(yù)后判斷具有較大的應(yīng)用價值與前景。在臨床實(shí)踐中通過單次測序即可同時獲得與CRC 有關(guān)的多個基因序列或全基因組信息，從而有助于臨床決策的制定［4］。

1 遺傳性CRC基因攜帶者的篩查

1.1 CRC的常見突變基因 體細(xì)胞基因突變，尤其是驅(qū)動基因突變導(dǎo)致的癌基因激活或抑癌基因失活，在惡性腫瘤的起始、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用［5］。具有明確遺傳基因突變的CRC僅占全部病例的5%左右，如Lynch 綜合征（Lynch syndrome，LS）、家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP）、Gardner綜合征、P-J綜合征等，若直系親屬有上述病史，建議利用NGS檢查相應(yīng)基因，以實(shí)現(xiàn)CRC的早期干預(yù)［6］。

癌癥基因組圖譜計劃（the cancer genome atlas，TCGA）顯示，在CRC 腫瘤標(biāo)本中除了已知的APC、TP53、RAS（KRAS、NRAS）、BRAF、PIK3CA等常見突變外，ARID1A、SOX9、FAM123B/WTX、CD44、DCC等突變及HER2、IGF2等擴(kuò)增的頻率也較高［7］。Díaz-Gay 等［8］對特定CRC 的全外顯子組測序數(shù)據(jù)綜合分析，得出BRCA2、BLM、ERCC2、RECQL、REV3L和RIF1是參與種系突變導(dǎo)致家族性CRC 易感性的潛在候選基因。

遺傳性 CRC 最多見的是 LS、FAP 和 MUTYH 相關(guān)性息肉?。∕UTYH-associated polyposis，MAP），分別表現(xiàn)為DNA 錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2）、APC、MUTYH突變。LS占CRC病例的2%～5%，Lynch陽性者患大腸癌的風(fēng)險高達(dá)80%，其主要分子基礎(chǔ)是MMR突變，進(jìn)而導(dǎo)致大范圍微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）［9］?！哆z傳性結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識（2018）》建議：初診CRC 患者應(yīng)檢測微衛(wèi)星狀態(tài)，初篩為MSI 則應(yīng)行MMR和EPCAM檢測。NGS 能夠識別突變基因，聯(lián)合NGS 與生物信息學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)以及動物模型等功能基因組學(xué)方法有利于推動對多種遺傳突變體致病性的解釋［10］。臨床可利用NGS 進(jìn)行突變基因篩查，作為早期發(fā)現(xiàn)CRC的方法之一。

1.2 NGS用于CRC基因突變檢測的臨床價值 NGS逐漸成為腫瘤分子診斷的有力工具［11］。Bai 等［12］強(qiáng)調(diào)了靶向NGS 的重要性，通過Ion Torrent 測序平臺分析 91 例直腸癌，結(jié)果顯示KRAS、TP53、APC、FBXW7、PIK3CA頻繁突變，BRAF、CTNNB1、ERBB2和SMAD4突變程度較輕；該研究還發(fā)現(xiàn)多重突變，主要涉及KRAS和APC或KRAS和TP53。Zhang等［13］利用基于逆轉(zhuǎn)錄探針的靶向NGS鑒定來自中國的早發(fā)性或家族性CRC 患者的高外顯率種系突變，該方法可識別7 種CRC 易感基因的突變，包括APC、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MUTYH和NTHL1，此方法的敏感度（99%）和特異度（98%）均較高。

黃凱等［14］使用多重 PCR 靶向富集結(jié)合 NGS 技術(shù)對17例CRC病例和14例正常樣本的MMR基因進(jìn)行檢測，在外顯子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)15 種突變，與Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果一致，而NGS更節(jié)約時間和成本，說明該技術(shù)適合MMR基因突變篩查。李麗娟等［15］使用Ion Torrent測序儀檢測108例CRC病理樣本的KRAS基因狀態(tài)，并與作為金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測序比較，符合率為94%，特異度為91.5%，敏感度高達(dá)100%，證實(shí)了 NGS 的臨床應(yīng)用價值。同樣，Gao 等［16］使用 Ion Torrent PGM 系統(tǒng)測定 51 例 CRC 組織的KRAS突變，該系統(tǒng)針對KRAS外顯子2 突變（13/51）顯示出與Sanger 測序100%的一致性，特異度和敏感度均較高，適用于臨床常規(guī)檢測。Wang等［17］驗(yàn)證基于擴(kuò)增子的靶向NGS對CRC組織的分析性能，在中值測序深度≥500 X 時，特異度為100%，敏感度為95%～100%；隨后，在大型多中心研究中獲得648 例中國CRC 患者的突變譜，鑒定出TP53（52.82%）、KRAS（46.68%）、APC（24.09%）、PIK3CA（18.94%）、SMAD4（9.47%）、BRAF（6.15%）、FBXW7（5.32%）、NRAS（4.15%）以及其他不常見的突變基因；此外，檢測到特定突變基因與某些臨床病理學(xué)特征具有相關(guān)性，如BRAF和PIK3CA在右半結(jié)腸癌中更普遍。以上研究明確了NGS 應(yīng)用于CRC 突變基因檢測的可行性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）的靶向治療

2.1 mCRC 的抗表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）治療 EGFR 的活化可激活 Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 和 PI3K/AKT/mTOR兩條胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞生長、增殖、遷移和血管生成等過程中發(fā)揮重要作用。EGFR 通路在惡性腫瘤中可過表達(dá)或異常激活，與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，因而成為治療的有效靶點(diǎn)。該通路可由KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA的突變持續(xù)激活，導(dǎo)致mCRC 患者對抗EGFR 單克隆抗體治療的耐藥［18-19］。此時，可以根據(jù)腫瘤組織的基因分型來指導(dǎo)靶向治療。

在眾多基因中，KRAS與CRC 高度相關(guān)，30%～40%的CRC 患者伴有該基因突變。KRAS基因已被《NCCN臨床實(shí)踐指南》列為CRC靶向治療的必檢項(xiàng)目，mCRC 患者需先檢測該基因突變情況繼而指導(dǎo)臨床用藥。如KRAS突變介導(dǎo)抗EGFR單抗的耐藥，則患者不應(yīng)接受抗EGFR 治療。同樣，《ESMO 共識指南》建議在抗EGFR 藥物治療前對KRAS和NRAS的外顯子2、3和4以及BRAF的外顯子15進(jìn)行檢測，不建議突變者使用上述靶向藥物［20］。目前針對RAS突變型腸癌，抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單抗聯(lián)合化療仍是主要治療手段。

由于靶向治療的復(fù)雜耐藥機(jī)制，許多患者會對指南推薦的治療藥物產(chǎn)生耐受。Hou 等［21］針對57例中國CRC患者的508種腫瘤相關(guān)基因行基于雜交捕獲的靶向NGS，該研究中突變最頻繁的基因是APC（68.4%）、TP53（56.1%）和KRAS（52.6%）；57.9%的 CRC 患者存在KRAS、NRAS和BRAF突變，17.5%具有上述基因野生型的患者存在PTEN、PIK3CA和HER2突變；在12.3%的患者中鑒定出HER2擴(kuò)增，可誘導(dǎo)下游信號激活并導(dǎo)致西妥昔單抗或帕尼單抗耐藥，因而無法從抗EGFR 治療中獲益；此外，EGFR、FGFR1、PDGFRA和MAP2K1突 變 也 被 認(rèn) 為 是 抗EGFR耐藥的主要潛在機(jī)制。由此可知，NGS或可成為判斷腫瘤突變譜以指導(dǎo)晚期CRC 患者個體化治療的關(guān)鍵。

2.2 局部晚期病例的新輔助化療 局部晚期CRC的標(biāo)準(zhǔn)療法包括新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT），NACT 聯(lián)用靶向藥物可為患者帶來生存獲益，但此方法并非適合所有患者。對于是否需要實(shí)施NACT 聯(lián)合靶向治療，應(yīng)先進(jìn)行腫瘤組織的基因突變檢測，再結(jié)合各項(xiàng)檢查結(jié)果、患者病情進(jìn)展等具體情況進(jìn)行綜合評估。

目前，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（intratumoral heterogeneity，ITH）已被認(rèn)為是化療和放療抵抗的機(jī)制?；谕蛔兊任换蚰[瘤異質(zhì)性（mutant-allele tumor heterogeneity，MATH）的NGS 算法可作為衡量ITH 的指標(biāo)，為CRC 的靶向治療提供潛在的生物標(biāo)志物［22-24］。Greenbaum等［25］應(yīng)用NGS檢測局部晚期直腸癌患者ITH 與NACT 療效之間的相關(guān)性，證明了較高的MATH 評分與NACT 較差的治療反應(yīng)有關(guān)。由此可見，術(shù)前使用NGS進(jìn)行分子篩選，通過MATH值量化腫瘤異質(zhì)性程度，便于臨床醫(yī)生為患者制定更加合理有效的治療方案。

3 CRC的療效預(yù)測及預(yù)后

3.1 聯(lián)合RAS、BRAF檢測 NGS 技術(shù)對 CRC 的療效預(yù)測及預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義，有助于臨床醫(yī)生進(jìn)行隨訪和管理。在mCRC的常規(guī)化療中加入靶向藥物可提高療效，對于RAS/BRAF野生型病例，GALGB 80405Ⅲ期研究提示西妥昔單抗更宜聯(lián)合FOLFOX（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶），貝伐珠單抗更宜聯(lián)合FOLFIRI（伊立替康+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶），左半結(jié)腸癌患者的預(yù)后較好［26］。臨床研究表明，若采用EGFR 單抗治療，RAS、BRAF的突變狀態(tài)會影響治療策略的有效性，被推薦為預(yù)測抗EGFR 療效的重要指標(biāo)，使用抗EGFR 治療的RAS/BRAF野生型患者的應(yīng)答率（response rate，RR）、無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總體生存期（overall survival，OS）均有改善，但在左右半結(jié)腸癌療效差異的問題上仍存在爭議［27-28］。

Vidal 等［29］利用 NGS 評估抗 EGFR 治療聯(lián)合化療 時RAS、BRAF、PIK3CA和EGFRS492R突 變 的mCRC患者的療效，發(fā)現(xiàn)4種基因均為野生型的患者反應(yīng)良好。Gong等［30］從138例mCRC中鑒定出一種新型KRAS突變（KRASR68S1），與預(yù)后較差有關(guān)。Jones 等［31］對 9 643 例 mCRC 行 NGS，旨在評價非V600BRAF突變的影響，在接受檢查的患者中，非V600 突變比例為2.2%（208 例），占全部BRAF突變的22%，與CRC亞型明顯相關(guān)且預(yù)后較好，表明NGS在mCRC的預(yù)后評估中具有重要參考價值。

Taieb等［32］采用AmpliSeq分析PETACC8臨床試驗(yàn)（FOLFOX+/-西妥昔單抗）中2 559 例Ⅲ期CRC 病例的RAS和BRAFV600E 突變，明確 908 例為陽性，其余1 651 例中有1 054 例進(jìn)行了NGS 檢測，分別有227 例（21.5%）和46 例（4.4%）新診斷為KRAS/NRAS和BRAF突變，使用FOLFOX+西妥昔單抗治療的RAS/BRAF野生型患者預(yù)后較好。隨后，Bruera等［33］采用Ion Torrent 對一線FIr-B/FOx（5-氟尿嘧啶與交替伊立替康/BEV 或奧沙利鉑）+貝伐珠單抗三聯(lián)化療的mCRC 患者行KRAS/NRAS/BRAF分析，結(jié)果顯示KRAS外顯子 2～4（KRAS2～4）、NRAS外顯子 2～4（NRAS2～4）、BRAF外顯子15（BRAF15）突變體普遍存在。Yang 等［34］對 1 例KRAS/NRAS/BRAF野生型mCRC 患者建立患者源性異種移植模型，經(jīng)NGS 檢測出HER2擴(kuò)增以及激活突變S310F，試驗(yàn)顯示阿法替尼療效顯著，后續(xù)隨訪該患者達(dá)到3 個月PFS 和臨床癥狀緩解，且無嚴(yán)重的不良反應(yīng)。以上研究進(jìn)一步表明高敏感度的NGS能夠動態(tài)監(jiān)測基因突變譜的變化，據(jù)此可對治療方案進(jìn)行實(shí)時調(diào)整，從而更密切地預(yù)測療效和預(yù)后。

3.2 聯(lián)合MSI 檢測 微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSI-H）已是公認(rèn)的Ⅱ期CRC 的預(yù)后及化療療效預(yù)測因子。具有MSIH 表型的Ⅱ期CRC 患者預(yù)后較好，不建議使用氟尿嘧啶類單藥輔助治療［35-36］。近年來，NGS 的進(jìn)步實(shí)現(xiàn)了MSI狀態(tài)的檢測［37］。Kim等［38］探討靶向NGS對MSI的識別能力，分析382個具有已知MSI的CRC樣本，鑒定出驗(yàn)證組的8個MSI-H，選擇體細(xì)胞突變負(fù)荷截斷值≥40 且I 指數(shù)≥9%作為檢測標(biāo)準(zhǔn)具有較高的敏感度和特異度。另外，為了探究MSI 的預(yù)后價值，Innocenti 等［39］在貝伐珠單抗聯(lián)合化療或西妥昔單抗聯(lián)合化療的一線治療mCRC 患者的療效研究（CALGB/SWOG 80405）中利用NGS評估貝伐珠單抗與西妥昔單抗的療效差異，結(jié)果表明，對存在MSI-H的患者而言，貝伐珠單抗組比西妥昔單抗組的OS更長。若貝伐珠單抗聯(lián)合化療的益處得到進(jìn)一步證實(shí)，該方案有望改善mCRC的預(yù)后。

3.3 聯(lián)合外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測 NGS 技術(shù)所用的檢測標(biāo)本大多為腫瘤組織，有創(chuàng)且難以反復(fù)獲取。然而，ctDNA可以先于影像學(xué)檢查提示腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，基于ctDNA的NGS算法也能為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期CRC患者提供新的選擇［40］。Osumi等［41］指明了ctDNA在CRC預(yù)后中的意義，表現(xiàn)為CRC的療效評估、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測以及耐藥監(jiān)測等方面。Zhang等［42］利用 NGS 測定西妥昔單抗治療的 15 例 CRC 患者外周血ctDNA 并以微滴式數(shù)字PCR 作為對照，NGS 的敏感度和特異度分別為87.5%和100%。基于NGS 的ctDNA 檢測在鑒定基因組變異時更具優(yōu)勢，可用于CRC 患者西妥昔單抗治療期間的實(shí)時監(jiān)測。

近年來，基因組學(xué)的進(jìn)展拓寬了NGS 技術(shù)從基礎(chǔ)科研到臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。NGS技術(shù)不僅有助于闡明CRC 的發(fā)病機(jī)制，而且能夠提供相關(guān)基因位點(diǎn)的突變信息，從而用于篩查高危人群，實(shí)現(xiàn)早期診斷，指導(dǎo)精準(zhǔn)治療，判斷療效及預(yù)后。雖然NGS仍處于起步階段，但前期研究已顯示其良好的應(yīng)用前景。相信隨著高通量測序數(shù)據(jù)庫的建立、法律法規(guī)的完善以及統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定，NGS 將會更廣泛地應(yīng)用于臨床，為CRC的診療提供參考。