李 娜 趙建清 黃 飛 袁 水 方 翟 高慶華，3*

(1塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

（2塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300）

（3 新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

在動物體內(nèi)優(yōu)勢卵泡成熟前LH 峰（LH surge）激增促使卵泡成熟并排卵，Dieleman 等[1]利用活體采卵技術(shù)（OPU，ovum pick-up）采集出現(xiàn)LH 峰后優(yōu)勢卵泡中的卵母細胞，其囊胚率和活胚率均高于未出現(xiàn)LH 峰卵泡中的卵母細胞。張美佳等[2]研究發(fā)現(xiàn)維持減數(shù)分裂阻滯關鍵化合物為環(huán)腺苷酸（cAMP，cyclic adenosine monophosphate）和環(huán)鳥苷酸（cGMP，cyclic guanosinc monophosphate），cAMP 水平降低會引起卵母細胞過早成熟導致其成熟和排卵不同步，影響卵母細胞受精能力。PDE3A 是卵母細胞特異表達的磷酸二酯酶（phosphodiesterases），能被LH 激活，從而下調(diào)卵母細胞中的cAMP 水平，啟動卵母細胞的成熟。LH 峰到來之前，來源于顆粒細胞的cGMP，通過縫隙連接到達卵母細胞內(nèi)，抑制了卵母細胞內(nèi)PDE3A 的活性，將卵母細胞成熟和排卵調(diào)至同步狀態(tài)。Younis等[3]提出LH 能促進卵母細胞的成熟，孔祥敏等[4]認為在促排卵周期中，LH水平較高時，能夠獲得較高的卵子數(shù)，提高獲卵率，對臨床妊娠率也是一種幫助。Okazaki等[5]研究了含有FSH 的成熟培養(yǎng)基中添加LH能夠上調(diào)顆粒細胞cAMP 水平刺激孕酮的分泌，分泌的孕酮能夠減少顆粒細胞增殖活性，加速減數(shù)分裂恢復。李凱等[6]認為LH 延遲生發(fā)泡破裂（GVBD，germinal vesicle breakdown）的同時，促進卵母細胞胞質(zhì)成熟，使綿羊卵母細胞的核質(zhì)成熟趨于同步，有助于綿羊卵母細胞的體外成熟以及受精后進一步的發(fā)育。Blondin 等[7]在奶牛超數(shù)排卵方案中于取卵前6 h對一半的母牛注射LH，OPU后發(fā)現(xiàn)注射LH雖未改變卵泡的大小但顯著提高了體外胚胎培養(yǎng)的胚胎發(fā)育率及囊胚率。目前LH 對綿羊卵裂后胚胎發(fā)育作用的研究較少，且大多數(shù)研究者認為LH 的添加濃度在5～20 μg/mL 時，能獲得較高的卵母細胞成熟率，但LH的最適添加濃度并沒有得到統(tǒng)一[8-10,15]。本試驗在TCM199成熟基礎培養(yǎng)液中分別添加5個濃度梯度的LH，比較不同濃度的LH 對綿羊卵母細胞的成熟率、受精率以及卵裂率的影響，以確定LH 的最適添加濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

促卵泡素（FSH）購自Reprobiol 公司，肝素鈉、促黃體素（LH）購自索萊寶，SOF液購自Caisson公司，胎牛血清（FBS）、雙抗（PS）、TCM199 培養(yǎng)基購自Giboc公司，昆侖一號精液稀釋液購自塔克藍公司，其余藥品均購自Sigma公司。

1.1.2 試劑配制

卵巢運輸液1 L：9 g NaCl+0.1 g（100 mg/L）青霉素+0.1 g（100 mg/L）鏈霉素。

采卵液1 L：9. 5 g TCM199 粉（9. 5 g/L）+0. 42 g NaHCO3（5 mM）+2. 383 g HEPES（10 mM）+2. 603 g HEPES-Na（10 mM）+0. 01 g 肝素鈉（10 mg/mL）+10 ml FBS（1%）+10 ml PS（1%）

卵母細胞基礎成熟培養(yǎng)液100 ml：TCM199 培養(yǎng)基90 ml+200 μL 5 mg/L FSH 濃儲液終濃度（10 μg/mL）+10 ml FBS（10%）+ 20 μL 10 mg/L E2濃儲液終濃度（2 μg/mL）+1 ml PS（1%）+0. 022 g 丙酮酸鈉（2 mM）+0.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1 mM）+0.0024 g L-胱氨酸（100μM）

配制不同濃度LH 的卵母細胞成熟液：卵母細胞基礎成熟培養(yǎng)液（0μg/mL）中LH的添加濃度分別為：5、10、15、20μg/mL

0. 1% 透明質(zhì)酸酶：0. 1 g 透明質(zhì)酸酶+100 mL PBS

精 子 獲 能 液10 ml：8 ml SOF 液+ 2 ml FBS（20%）+0. 01 g 肝素鈉（10 mg/mL）+0. 0044 g 乳酸鈣（2 mM）

受精液10 ml：8 ml SOF 液+ 2 ml FBS（20%）+0.005 g肝素鈉（5 mg/mL）+0.0011 g乳酸鈣（0.5 mM）

胚胎培養(yǎng)液10 ml：10 ml SOF 液+0. 1 ml NEAA（1%）+0. 2 ml EAA（2%）+0. 005 g 肌醇（2. 77 mM）+0. 05 ml 200 mM L-谷氨酰胺（1 mM）+0. 06 g BSA（6 mg/mL）+0. 0004 g 葡萄糖（0. 25 mM）+0. 1 ml PS（1%）

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：MC0-15A），日本三洋公司制造；高壓滅菌鍋（型號：SX-500），日本TOMY 公司制造；倒置熒光顯微鏡（型號：TS100-FNikon），尼康公司制造；超凈工作臺（SWCJ-2FD），博訊公司制造；臺式高速冷凍離心機（型號：Sigma 3K30），Sigma公司制造。

1.2 方法

1.2.1 離體卵巢采集

綿羊卵巢采自阿克蘇市屠宰場。阿克蘇地區(qū)成年母羊屠宰后立即取下雙側(cè)卵巢，用75%乙醇噴洗，放入37 ℃滅菌（加雙抗）生理鹽水中2～3 h 內(nèi)運回實驗室。

1.2.2 卵丘-卵母細胞復合體（COCs）采集

采用切割法收集卵母細胞。采集發(fā)情季節(jié)綿羊卵巢，用75%乙醇快速清洗3 遍，37 ℃無菌生理鹽水中清洗3遍。在無菌培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片劃破卵泡后用裝有采卵液的注射器沖洗卵泡腔，使卵母細胞流入采卵液中。沉淀數(shù)分鐘，在體式顯微鏡下?lián)炻裑11]。

1.2.3 COCs選擇

在體視顯微鏡下選擇A、B 級COCs 進行成熟培養(yǎng)。A級卵母細胞要求有顆粒細胞3層以上，且緊密包圍卵母細胞顆粒細胞擴張充分；B 級要求卵母細胞胞質(zhì)均勻，顆粒細胞少于等于3層大于2層。

1.2.4 COCs成熟培養(yǎng)

采用微滴培養(yǎng)法。在無菌環(huán)境下制作成熟培養(yǎng)微滴，將挑選A、B 級COCs 用IVM 液清洗3 遍轉(zhuǎn)入預先平衡好的微滴中，每個微滴放入30 枚COCs。在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中以5%CO2、38.5 ℃、飽和濕度培養(yǎng)24 h，觀察卵丘的擴散，并做好記錄。

1.2.5 觀察第一極體排出情況

成熟培養(yǎng)24 h 用自制口吸管將COCs 轉(zhuǎn)移至含0.1%透明質(zhì)酸酶的PBS 中，200μL 移液槍反復吹打至COCs 周圍顆粒細胞脫落露出透明帶，在IVF 液中洗三遍，放置體視鏡下用細玻璃管撥動卵母細胞觀察第一極體排出情況，記錄排出第一極體的卵母細胞數(shù)。

1.2.6 顆粒細胞培養(yǎng)

用胚胎發(fā)育液在35 mm 培養(yǎng)皿中制作70 μL的微滴（石蠟油覆蓋，CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h 以上）。將透明質(zhì)酸酶脫離的顆粒細胞接種至微滴中，在38.5 ℃、5% CO2、100%濕度的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 精子上游

電刺激采集綿羊精液，1:4的比例添加稀釋液，按照昆侖一號說明書操作步驟進行稀釋。取0.5 mL稀釋精液緩慢注入含1 mL 精子獲能液的離心管底部，傾斜45°，置于38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，取上清液1 mL，800 ×g 離心5 min，棄上清液，重復一次。

1.2.8 體外受精

脫去顆粒細胞的成熟卵母細胞，用受精液清洗3次后放入50μL 覆蓋有石蠟油的受精液微滴中，單個微滴最多15 枚COCs。取上游精液加入受精微滴中（精子密度大約為1×106個/mL），在38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中精卵共孵18 h。

1.2.9 胚胎體外培養(yǎng)

預先平衡70μL 胚胎發(fā)育液，將受精后的受精卵放入胚胎發(fā)育液中洗掉周圍精子后放入發(fā)育液中，顆粒細胞與受精卵于CO2恒溫培養(yǎng)38.5 ℃、5%CO2、100%濕度共孵，24 h記錄卵母細胞卵裂數(shù)。每隔2 d進行一次半量換液，胚胎發(fā)育第4 d 解除顆粒細胞與胚胎共孵培養(yǎng)，144 h統(tǒng)計桑椹胚的數(shù)量。

1.2.10 統(tǒng)計分析

每個試驗組都重復3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析進行顯著性檢驗，LSD多重比較差異，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準，結(jié)果用平均值±標準差表示。

成熟率=成熟COCs總數(shù)/COCs總數(shù)×100%

卵裂率=卵裂卵母細胞總數(shù)/成熟COCs總數(shù)×100%

桑椹胚率=桑椹胚總數(shù)/成熟COCs×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LH對COCs成熟率的影響

本試驗將卵丘擴散疏松（如圖1-A 所示），第一極體排出胞質(zhì)均勻的COCs（如圖1-B 所示），記為成熟COCs。不同濃度LH 成熟培養(yǎng)液中成熟情況見表1。由表1 可見，C 組COCs 的成熟率顯著高于其它組（P＜0.05），B、D、E 組COCs 的成熟率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同濃度的LH 對COCs成熟率的影響

2.2 不同濃度LH對卵裂率的影響

成熟卵母細胞卵裂率見表2。由表2 可見，C 組培養(yǎng)成熟的COCs 其卵裂率顯著高于其它各組（P＜0.05），B、D、E各組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同濃度的LH對卵裂率的影響

2.3 不同濃度的LH對桑葚胚率的影響

桑椹胚見圖2-C，卵裂后桑椹胚發(fā)育情況見表3。由表3 可見，C 組培養(yǎng)成熟的COCs 顯著高于其它各組（P＜0.05），D、E組間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同濃度的LH對桑葚胚率的影響

圖1 卵母細胞成熟

圖2 桑椹期胚胎

3 討論

Figueiredo 等[12]認為小于8 mm 的牛卵泡中，顆粒細胞只表達FSHR mRNA ，而沒有LHR mRNA 表達，故單獨添加不同濃度的LH 不能提高卵母細胞的成熟。但Fu 等[13]利用RT-PCR 及原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)FSH 刺激的卵母細胞減數(shù)恢復與顆粒細胞上的LHR mRNA 表達密切相關，單獨添加LH 對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂起始無影響。胡艷明等[14]在成熟培養(yǎng)液中單獨添加10μg/mL 的LH 時，延邊黃牛卵母細胞體外成熟率和卵裂率分別為80. 6%和79. 8%，其成熟率顯著高于添加0 μg/mL、5 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL，與本試驗含10 μg/mL FSH 添加10 μg/mL LH 所得成熟率76. 60%基本相近。本試驗基礎成熟液中含10 μg/mL 的FSH，結(jié)果表明添加10 μg/mL 的LH，卵母細胞的成熟率最高且顯著高于其他添加濃度，而成熟率的提高是否與LHR mRNA 的表達相關需要進行分子試驗驗證。FSH和LH在卵母細胞成熟過程中具有協(xié)同作用，本試驗未探究FSH 和LH 添加比例對卵母細胞成熟的影響，僅在添加10 μg/mL FSH 的基礎上添加不同濃度的LH，王娟等[15]在灘羊卵母細胞成熟培養(yǎng)時同時添加40 μg/mL LH 和200 μg/mL FSH 成熟率達到68.8%，F(xiàn)SH 和LH 的添加濃度均高于本試驗10μg/mL LH 和10μg/mL FSH，原因可能是激素的生產(chǎn)廠家不同其純度會有所差異，使得激素的添加濃度差異較大。楊恕玲等[16]認為20μg/mL LH是灘羊卵母細胞體外成熟的最佳添加劑量，較本試驗得出10 μg/mL 最佳添加劑量較高，原因可能是阿克蘇地區(qū)綿羊與灘羊品種不同。潘文平等[17]在山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)試驗中用LH 處理后卵母細胞成熟率顯著高于未添加組。因此，添加LH 能提高COCs 的成熟、卵裂率及桑椹胚率。且本試驗結(jié)果表明添加10μg/mL LH 能顯著提高卵母細胞成熟率、卵裂率及桑椹胚率。

Chebrout 等[18]認為顆粒細胞的擴散程度能夠反映出卵母細胞的成熟情況。孫桂金[19]和周佰成[20]認為10 μg/mL FSH/LH 為綿羊卵母細胞體外成熟的最適添加濃度，與本試驗最適添加濃度一致，但在孫桂金[19]的試驗中綿羊卵母細胞的成熟率為68.60%，與本試驗成熟率（77.71%）相比較低，其原因可能是采集的卵母細胞質(zhì)量不同而造成的差異。李凱等[6]添加10μg/mL 的LH 時綿羊的卵裂率顯著高于對照組，與本試驗結(jié)果一致。衛(wèi)恒習[8]認為添加LH 對綿羊的卵裂率無明顯作用，造成差異的原因可能是：一是成熟培養(yǎng)液中其他添加物質(zhì)不相同，二是成熟卵母細胞的質(zhì)量和精子活力造成差異。LH能夠提高卵母細胞的受精率和卵裂率，原因是LH 具有暫時性抑制生發(fā)泡的破裂，延遲卵母細胞核成熟的作用，使卵母細胞有更長的時間來完成胞質(zhì)成熟[21]，LH 同時關閉卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙連接，使卵母細胞從減數(shù)分裂抑制的狀態(tài)中解除出來[22]。卵母細胞的成熟質(zhì)量決定著后期受精和胚胎發(fā)育情況。

4 結(jié)論

在含有10 μg/mL FSH 的TCM199 成熟培養(yǎng)液中添加10μg/mL LH 的綿羊卵母細胞的成熟率、受精率和卵裂率均顯著高于其他添加組（P＜0. 05）。LH 濃度為10μg/mL 時對綿羊卵母細胞體外成熟及受精發(fā)育效果最好。