田 香，熊 琪，陳 琳，文若劍，茹 琴

江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，武漢 430056

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過程[1- 2]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明，目前最經(jīng)典的理論是Day[3]提出的“二次打擊”學(xué)說。其中“初次打擊”是以胰島素抵抗為中心而導(dǎo)致的肝脂肪變，包括肝臟脂肪積聚、脂代謝紊亂，使肝對外界刺激敏感性增加?！岸未驌簟敝饕歉鞣N致病因素而引發(fā)的氧化應(yīng)激使反應(yīng)性氧化物和脂質(zhì)過氧化物增多，導(dǎo)致細(xì)胞炎性因子釋放增加，從而促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)展為炎癥和病變壞死。隨著社會(huì)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD發(fā)病率逐年升高且呈低齡化趨勢，已成為一種危害人類健康的常見慢性肝臟疾病[4- 5]。梓醇是從地黃中提取的環(huán)烯醚萜類化合物，是地黃主要有效活性成分之一，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗肝損傷等多種藥理作用[6- 8]，但關(guān)于梓醇對NAFLD干預(yù)作用的研究報(bào)道較少。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，探討梓醇對NAFLD的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制，為臨床NAFLD的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

試劑與儀器梓醇(純度98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司)；阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium，ATC)(湖北巨勝科技有限公司)；脂肪供能比10%的低脂飼料和脂肪供能比45%的高脂飼料(貨號(hào)：MD12031和MD12032)(江蘇美迪森生物醫(yī)藥公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(貨號(hào)：C009- 2)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒(貨號(hào)：C010- 2)、總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(貨號(hào)：A111- 2)、三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒(貨號(hào)：A110- 2)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(貨號(hào)：A112- 1)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(貨號(hào)：A113- 1)(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒(貨號(hào)：JYM0218Mo)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β試劑盒(貨號(hào)：JYM0531Mo)和IL- 6試劑盒(貨號(hào)：JYM0012Mo)(武漢基因美生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液(武漢谷歌生物科技有限公司)；核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65抗體(貨號(hào)：8242P)、核因子抑制蛋白Bα(inhibitor of nuclear factor kappa-B α，IκBα)抗體(貨號(hào)：4812S)、B淋巴細(xì)胞瘤- 2(B-cell lymphoma- 2，Bcl- 2)抗體(貨號(hào)：3498)、Bcl- 2相關(guān)x蛋白(Bcl- 2 associated x protein，Bax)抗體(貨號(hào)：2772)、半胱天冬酶- 3(Caspase- 3)抗體(貨號(hào)：9662)和GAPDH抗體(貨號(hào)：2118S)(美國CST公司)；化學(xué)發(fā)光顯色試劑(貨號(hào)：34077)(美國Thermo公司)；HM 340E石蠟切片機(jī)、EC 350包埋機(jī)(德國Microm 公司)；CM 1860冰凍組織切片機(jī)(德國Leica公司)；正置光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)(BX51，日本Olympus株式會(huì)社)；MULTISKAN GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀、MULTIFUGF X1R低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，體重22～26 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)為：11400700213032)，飼養(yǎng)于江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可編號(hào)：SYXK(鄂)2012- 0042]。實(shí)驗(yàn)獲得江漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)授權(quán)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周，自由采食和飲水。

分組及給藥小鼠按各組體重?zé)o差異隨機(jī)分為6組，每組10只。根據(jù)董韡等[9]對地黃中梓醇急性毒性實(shí)驗(yàn)研究及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，梓醇干預(yù)濃度設(shè)為低、中、高3個(gè)劑量，分別為100、200和400 mg/kg，分組與處理如下：(1)正常對照組：喂食低脂純化配方飼料，灌胃給予等體積生理鹽水；(2)模型組：喂食高脂純化配方飼料，灌胃給予等體積生理鹽水；(3)梓醇低劑量組：喂食高脂純化配方飼料，灌胃給予梓醇100 mg/kg；(4)梓醇中劑量組：喂食高脂純化配方飼料，灌胃給予梓醇200 mg/kg；(5)梓醇高劑量組：喂食高脂純化配方飼料，灌胃給予梓醇400 mg/kg；(6)ATC組：喂食高脂純化配方飼料，灌胃給予ATC 30 mg/kg。各組動(dòng)物均自由采食和飲水，連續(xù)喂養(yǎng)18周。

小鼠體重及肝指數(shù)在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每周對小鼠稱重并記錄，觀察整體情況及變化趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量小鼠體重及肝重，以肝臟濕重/小鼠體重×100%計(jì)算肝指數(shù)。

小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測干預(yù)18周后，禁食不禁水12 h，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動(dòng)物，摘眼球取血，靜置2 h后4℃ 3000 r/min(轉(zhuǎn)子半徑8 cm)離心10 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書分別檢測小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C以及ALT和AST的含量。

小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察肝臟標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，油紅O染色觀察肝組織脂肪蓄積情況，HE染色觀察肝組織脂肪變性及損傷程度并拍照。

小鼠血清炎癥因子測定按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL- 1β和IL- 6的含量。

Western blot檢測肝組織蛋白表達(dá)水平取適量放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解液勻漿肝組織并測定蛋白濃度上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，與一定比例稀釋后的一抗在4℃環(huán)境中孵育過夜(NF-κB p65抗體、IκBα抗體、Bcl- 2抗體、Caspase- 3抗體和GAPDH抗體按1∶1000稀釋，Bax抗體按1∶500稀釋)，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液洗膜后置于辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗中室溫孵育1 h，洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯色，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光成像。以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以正常對照組為參照進(jìn)行歸一化處理。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

梓醇對高脂飲食小鼠體重及肝指數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組小鼠攝食量基本保持一致，并于每6周記錄各組小鼠體重情況(表1)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組小鼠體重基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。飼養(yǎng)18周后，模型組小鼠體重顯著高于正常對照組(P=0.001)，梓醇各劑量組和ATC組小鼠體重及體重增重均顯著低于模型組(P均=0.001)。與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P=0.001)，梓醇中、高劑量組(P均=0.001)和ATC組(P=0.001)小鼠肝臟指數(shù)比模型組顯著降低(表2)。

表1 各組小鼠0、6、12、18周體重情況Table 1 The body weight of mice in 0，6，12 and 18 weeks in each

ATC：阿托伐他汀鈣；P1：模型組與正常對照組比較；P2：梓醇低劑量組與模型組比較；P3：梓醇中劑量組與模型組比較；P4：梓醇高劑量組與模型組比較；P5：ATC組與模型組比較

ATC：atorvastatin calcium；P1：model group was compared with control group；P2：catalpol low dose group was compared with model group；P3：catalpol middle dose group was compared with model group；P4：catalpol high dose group was compared with model group；P5：ATC group was compared with model group

表2 梓醇對小鼠體重和肝指數(shù)的影響Table 2 Effect of catalpol on body weights and liver index of

P1：模型組與正常對照組比較；P2：梓醇低劑量組與模型組比較；P3：梓醇中劑量組與模型組比較；P4：梓醇高劑量組與模型組比較；P5：ATC組與模型組比較

P1：model group was compared with control group；P2：catalpol low dose group was compared with model group；P3：catalpol middle dose group was compared with model group；P4：catalpol high dose group was compared with model group；P5：ATC group was compared with model group

梓醇對高脂飲食小鼠血脂和肝功能的影響與正常對照組相比，模型組小鼠血清TC(P=0.001)、TG(P=0.001)、LDL-C(P=0.001)水平顯著升高，HDL-C(P=0.001)水平顯著降低。與模型組相比，梓醇低劑量組小鼠血清TC、TG和LDL-C含量及梓醇低、中劑量組小鼠血清HDL-C含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，梓醇中、高劑量組小鼠血清TC(P=0.005，P=0.001)、TG(P均=0.001)和LDL-C(P均=0.001)含量顯著降低，梓醇高劑量組HDL-C含量顯著增加(P=0.009)。另外，模型組小鼠血清ALT和AST水平與正常對照組相比顯著升高(P均=0.001)。與模型組相比，梓醇3個(gè)劑量組和ATC組小鼠血清ALT(P=0.004，P=0.001，P=0.001，P=0.001)和AST(P=0.008，P=0.001，P=0.001，P=0.001)水平均顯著降低(表3)。

梓醇對高脂飲食小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響HE染色結(jié)果顯示正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，清晰可見，少見脂肪變性。模型組小鼠可見肝小葉界限不清，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的氣球樣脂肪空泡，呈現(xiàn)明顯的脂肪變性，炎性細(xì)胞彌散分布在脂肪樣變肝組織中。與模型組相比，梓醇各劑量組和ATC組小鼠肝臟脂肪變性減輕，胞漿內(nèi)脂肪空泡數(shù)量減少，體積變小，病變程度有所緩解(圖1A)。油紅O染色結(jié)果顯示正常對照組小鼠肝細(xì)胞胞漿中有少量紅色物質(zhì)，模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)沉積大量脂肪被染成紅色，梓醇各劑量組和ATC組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)沉積脂肪與模型組相比有所減少(圖1B)。

梓醇對高脂飲食小鼠血清炎癥因子的影響模型組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6與正常對照組相比顯著升高(P均=0.001)；梓醇各劑量組和ATC組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6濃度較模型組顯著降低(P均=0.001)(表4)。

梓醇對高脂飲食小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)水平的影響與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著上升(P=0.007)，IκBα蛋白表達(dá)水平顯著下降(P=0.002)。與模型組相比，梓醇各劑量組及ATC組肝組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P=0.014，P=0.001，P=0.001，P=0.001)，IκBα的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.028，P=0.001，P=0.001，P=0.001)(圖2)。

表3 梓醇對小鼠血清TC、 TG 、LDL-C、HDL-C以及ALT和AST水平的影響Table 3 Effects of catalpol on serum TC，TG，LDL-C，HDL-C，ALT and AST levels in

TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；P1：模型組與正常對照組比較；P2：梓醇低劑量組與模型組比較；P3：梓醇中劑量組與模型組比較；P4：梓醇高劑量組與模型組比較；P5：ATC組與模型組比較

TC：total cholesterol；TG：triglyceride；LDL-C：low-density lipoprotein cholesterol；HDL-C：high-density lipoprotein cholesterol；ALT：alanine aminotransferase；AST：aspartate transaminase；P1：model group was compared with control group；P2：catalpol low dose group was compared with model group；P3：catalpol middle dose group was compared with model group；P4：catalpol high dose group was compared with model group；P5：ATC group was compared with model group

1.正常對照組；2.模型組；3.梓醇低劑量組；4.梓醇中劑量組；5.梓醇高劑量組；6.ATC組；箭頭：炎性細(xì)胞

1.control group；2.model group；3.catalpol low dose group；4.catalpol middle dose group；5.catalpol high dose group；6.ATC group；arrows show inflammatory cells

圖1小鼠各組肝組織HE染色(A)和油紅O(B)染色結(jié)果(×400)

Fig1Hematoxylin-eosin staining(A)and oil red O staining(B)of the liver tissues in each group of mice(×400)

表4 梓醇對小鼠血清TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平的影響Table 4 Effects of catalpol on serum TNF-α、IL- 1β and IL- 6 levels in

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素；P1：模型組與正常對照組比較；P2：梓醇低劑量組與模型組比較；P3：梓醇中劑量組與模型組比較；P4：梓醇高劑量組與模型組比較；P5：ATC組與模型組比較

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL：interleukin；P1：model group was compared with control group；P2：catalpol low dose group was compared with model group；P3：catalpol middle dose group was compared with model group；P4：catalpol high dose group was compared with model group；P5：ATC group was compared with model group

NF-κB：核因子κB；IκBα：核因子抑制蛋白Bα；Mr：相對分子質(zhì)量；CG：正常對照組；MG：模型組；CLG：梓醇低劑量組；CMG：梓醇中劑量組；CHG：梓醇高劑量組；AG：ATC組；與CG組比較，aP< 0.01；與MG組比較，bP< 0.05，cP< 0.01

NF-κB：nuclear factor kappa-B；IκBα：inhibitor of nuclear factor kappa-B α；Mr：relative molecular mass；CG：control group；MG：model group；CLG：catalpol low dose group；CMG：catalpol middle dose group；CHG：catalpol high dose group；AG：ATC group；aP<0.01 compared with CG group；bP< 0.05，cP< 0.01 compared with MG group

A.小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)；B.NF-κB p65蛋白定量分析；C.IκBα定量分析

A.protein expression of NF-κB p65 and IκBα in the livers of mice；B.quantitative analysis of NF-κB p65 protein；C.quantitative analysis of IκBα protein

圖2梓醇對高脂飲食小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)水平的影響

Fig2Effects of catalpol on the expression of NF-κB p65 and IκBα in the livers of high fat diet-fed mice

梓醇對高脂飲食小鼠肝臟組織中Bcl- 2/Bax和Caspase- 3蛋白表達(dá)水平的影響與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中Bcl- 2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P=0.009)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P=0.001)，二者比值(Bcl- 2/Bax)顯著降低(P=0.001)，凋亡蛋白Caspase- 3表達(dá)水平也顯著升高(P=0.001)。與模型組相比，梓醇高劑量組及ATC組Bcl- 2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P=0.032，P=0.014)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P=0.026，P=0.001)，二者比值(Bcl- 2/Bax)顯著升高(P=0.003)，凋亡蛋白Caspase- 3表達(dá)水平隨之顯著降低(P均=0.001)(圖3)。

Bcl- 2：B淋巴細(xì)胞瘤- 2；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤- 2相關(guān)x蛋白；與CG組比較，aP<0.01；與MG組比較，bP< 0.01

Bcl- 2：B-cell lymphoma- 2；Bax：Bcl- 2 associated x protein；aP< 0.01 compared with CG group；bP< 0.01 compared with MG group

A.小鼠肝組織中Bcl- 2、Bax和半胱天冬酶- 3蛋白表達(dá)；B.Bcl- 2/Bax比值；C.半胱天冬酶- 3蛋白定量分析

A.protein expression of Bcl- 2，Bax and Caspase- 3 in the livers of mice；B.Bcl- 2/Bax ratio；C.quantitative analysis of Caspase- 3 protein

圖3梓醇對高脂飲食小鼠肝組織中Bcl- 2/Bax和半胱天冬酶- 3蛋白表達(dá)水平的影響

Fig3Effects of catalpol on the expressions of Bcl- 2/Bax and Caspase- 3 in the livers of high fat diet-fed mice

討 論

脂肪肝的產(chǎn)生是由于肝細(xì)胞質(zhì)變和脂肪蓄積過多導(dǎo)致的，脂質(zhì)代謝異常、細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等因素在NAFLD的發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。高脂飼料飼養(yǎng)的動(dòng)物模型是目前最常用的NAFLD動(dòng)物模型，它模擬了人類NAFLD的發(fā)生發(fā)展和病變特征，過程中可出現(xiàn)全身代謝紊亂特征，模型肝組織漸進(jìn)性發(fā)展的病變過程符合人類肝病慢性發(fā)展的特點(diǎn)[11]。國內(nèi)已有研究表明梓醇具有改善糖脂代謝的作用[12- 13]，但對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的干預(yù)作用尚未見報(bào)道。本研究旨在探討梓醇對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的預(yù)防作用，并初步分析其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)研究顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠經(jīng)梓醇干預(yù)后，體重及肝指數(shù)顯著降低，血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低、HDL-C水平顯著升高，病理組織切片結(jié)果顯示肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及氣球樣脂肪病變程度降低；血清炎癥因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6釋放減少，血清ALT及AST水平也顯著降低。以上結(jié)果表明梓醇可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積、肝臟損傷及炎癥反應(yīng)。

已有研究顯示1 g/kg梓醇干預(yù)后糖尿病db/db小鼠血清中TG水平顯著降低，HDL水平顯著升高，可能是由于梓醇使db/db小鼠肝組織中乙酰輔酶A羧化酶與羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶蛋白表達(dá)下降，AMP依賴的蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α，AMPKα)磷酸化水平表達(dá)增加，從而改善鼠肝臟胰島素抵抗，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[14]。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白- 1c(sterol regulatory element binding protein- 1c，SREBP- 1c)是脂代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)肝內(nèi)TG的合成和貯存，是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控者，在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[15]。相關(guān)研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過調(diào)節(jié)SREBP- 1c表達(dá)與激活對肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16- 17]。本研究梓醇顯著降低了高脂飲食小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高了HDL-C水平，并且降低了肝臟脂質(zhì)蓄積，對NAFLD發(fā)病起到了預(yù)防作用，提示梓醇可能通過調(diào)控AMPKα磷酸化、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及下調(diào)SREBP- 1c基因的表達(dá)預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

NF-κB作為多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的上游信號(hào)分子，在NAFLD發(fā)病過程中起到了重要的作用[18]。NF-κB信號(hào)通路的激活是關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，它通過促進(jìn)多種炎癥因子如TNF-α、IL- 1β、IL- 6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加炎性介質(zhì)的釋放，而這些炎性介質(zhì)反過來作用于NF-κB的活化，繼而進(jìn)一步激活NF-κB的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步放大[19- 20]。IκB抑制蛋白家族是NF-κB重要的內(nèi)源性抑制因子，是調(diào)控NF-κB活性的主要因素之一[21]。長期的高脂飲食可通過上述途徑誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝內(nèi)的炎癥因子水平升高，最終引起NAFLD[22]。陳芝蕓等[23]研究顯示在高脂飲食模型組大鼠肝組織中NF-κB p65表達(dá)高于正常對照組大鼠，推測NF-κB可能參與高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD損傷過程。劉慶生等[24]研究顯示理氣化痰祛瘀中藥通過調(diào)控NF-κB的表達(dá)實(shí)現(xiàn)治療脂肪肝的目的。本研究顯示梓醇干預(yù)的小鼠肝組織中NF-κB p65的蛋白表達(dá)顯著降低，IκBα的蛋白表達(dá)顯著升高，且小鼠血清炎性因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6釋放顯著降低。由此可推測梓醇對NAFLD預(yù)防作用可能通過抑制NF-κB的激活減少炎性因子的釋放，從而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝組織炎癥損傷實(shí)現(xiàn)。

近年來，越來越多證據(jù)表明在NAFLD中肝細(xì)胞凋亡可能是單純非酒精性脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎的關(guān)鍵步驟，也是該過程的重要標(biāo)志，與炎癥程度和纖維化進(jìn)展相關(guān)，肝細(xì)胞脂肪病變越嚴(yán)重，肝細(xì)胞凋亡越多[25]。NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中，肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及一系列基因的表達(dá)和多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Bcl- 2通路可能在NAFLD早期參與對肝細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，并貫穿于整個(gè)病變過程[26- 27]。Bcl- 2和Bax是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)物，Bcl- 2高表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bax則發(fā)揮拮抗作用，二者比值(Bcl- 2/Bax)是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[28]。已有研究顯示白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)NAFLD大鼠肝細(xì)胞中Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)，增加二者比值，從而降低肝細(xì)胞的凋亡，保護(hù)肝組織，維持肝細(xì)胞的正常功能，改善或減緩NAFLD發(fā)展的進(jìn)程[29]。Caspase- 3作為Caspase家族最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用[30]。此外，在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的異常開放可導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化解耦聯(lián)、ATP衰竭、線粒體腫脹及內(nèi)膜嵴消失，從而促使細(xì)胞色素C和相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子釋放到胞漿，活化凋亡蛋白家族的主要成員胱冬肽酶，觸發(fā)瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[31]。吳方等[32]研究結(jié)果表明線粒體-細(xì)胞色素C途徑在NAFLD引起的肝細(xì)胞凋亡中起到了一定的調(diào)控作用。與之研究結(jié)果相似，本研究顯示梓醇干預(yù)組NAFLD小鼠肝組織中Bcl- 2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，二者比值(Bcl- 2/Bax)增加，另外，Caspase- 3蛋白表達(dá)水平降低，推測梓醇可能通過調(diào)節(jié)MPTP開放降低線粒體損傷和細(xì)胞色素C的釋放，從而起到預(yù)防肝細(xì)胞凋亡的作用。

肝臟脂質(zhì)蓄積、炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)及肝細(xì)胞凋亡必會(huì)加重肝細(xì)胞損傷。ALT和AST是肝功能損害的生物標(biāo)志物，當(dāng)肝功能受損時(shí)，血液中ALT和AST水平升高[33]。本研究顯示與模型組相比，梓醇干預(yù)后高脂飲食組小鼠血清中ALT和AST水平顯著降低，提示梓醇可能通過減少肝臟脂質(zhì)蓄積、炎癥反應(yīng)和抑制肝細(xì)胞凋亡降低高脂飲食對小鼠肝臟的損傷。

綜上，本研究顯示梓醇可有效調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠體重及肝指數(shù)的增加、脂代謝紊亂、肝臟脂肪變性及脂質(zhì)蓄積，并能抑制炎性反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，對NAFLD的發(fā)病起到預(yù)防作用。本研究為梓醇應(yīng)用開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。