吳婉儀 李 璐 李達(dá)鴻 解新安 李 雁
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州 510642)
番茄紅素作為一種天然類胡蘿卜素被廣泛應(yīng)用于食品、藥物和化妝品之中,具有增強(qiáng)人體免疫力、防治疾病和抗氧化等功效。然而,由于結(jié)構(gòu)中存在多不飽和雙鍵,番茄紅素水溶性極差,且對(duì)氧氣、光照、熱等外在條件較為敏感,這些都嚴(yán)重限制了其在食品加工中的應(yīng)用[1-2]。納米乳液作為載運(yùn)體系可顯著提高此類生物活性物質(zhì)的溶解性和生物利用率[3-4]。
納米乳液作為功能性營(yíng)養(yǎng)成分的載運(yùn)體系,體系的穩(wěn)定性研究是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域[5-6]。目前對(duì)影響納米乳液穩(wěn)定性的研究多針對(duì)小分子乳化劑[7-10],而對(duì)于利用較為安全的生物兼容大分子乳化劑制備納米乳液的穩(wěn)定機(jī)理研究并不多[11-13],較少?gòu)募{米乳液的不穩(wěn)定現(xiàn)象分析和應(yīng)用穩(wěn)定性等方面探討穩(wěn)定機(jī)理。本研究采用食品級(jí)辛烯基琥珀酸酯化淀粉 (OSA變性淀粉)為大分子乳化劑,以MCT為油相,采用高壓均質(zhì)法,根據(jù)課題組前期研究確定的最佳制備工藝制備負(fù)載番茄紅素納米乳液,利用基于光散射原理的Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析儀分析乳液的不穩(wěn)定現(xiàn)象,考察不同的儲(chǔ)藏環(huán)境因素對(duì)納米乳液穩(wěn)定性的影響,并對(duì)其在食品體系中的應(yīng)用穩(wěn)定性進(jìn)行研究。本試驗(yàn)研究結(jié)果將為納米乳液體系的穩(wěn)定機(jī)理研究和實(shí)際應(yīng)用提供較好的數(shù)據(jù)參考。
辛烯基琥珀酸酯化淀粉(OSA 變性淀粉),廣東佛山德峰淀粉糖業(yè)有限公司;中鏈甘油三酯(MCT),廣州耶尚貿(mào)易公司;番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品(≥90%),上海源葉生物科技有限責(zé)任公司;二甲亞砜(分析純),天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;二氯甲烷(分析純),廣東光華科技股份有限公司;正己烷(分析純),廣東光華科技股份有限公司;氯化鎂(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠;蔗糖 (分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠;氯化鈉(分析純),天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。
Scientz-150高壓均質(zhì)機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;FJ200高速分散均質(zhì)攪拌器,上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;UV-2500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),德國(guó)斯派克分析儀器公司;Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析測(cè)試儀,法國(guó)Formulaction公司;納米粒度及Zeta電位分析儀,Zetasizer Nano ZS90,英國(guó)Malvern公司。
首先在70℃下將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的辛烯基琥珀酸酯化淀粉溶解于去離子水,并在常溫下攪拌過(guò)夜,使其充分水化,制得水相。然后將番茄紅素溶解于MCT油中,配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%番茄紅素油溶液,并采用磁力攪拌器攪拌,直至番茄紅素完全溶解于油相中為止。接著將水相與油相按9∶1的比例混合攪拌均勻后,在高速分散機(jī)上以18 000 r/min分散4 min制得粗乳液,再將制得的粗乳液在110 MPa下均質(zhì)3次得到番茄紅素納米乳液。在制備過(guò)程中,所有的容器均使用錫箔紙包裹,以減少番茄紅素的損失。
乳液采用Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)定其粒徑大小和Zeta電位,測(cè)定溫度固定在25℃,所有的乳液均使用去離子水稀釋100倍后再進(jìn)行檢測(cè)。
1.5.1 乳液中番茄紅素含量的測(cè)定 番茄紅素溶液在低濃度范圍內(nèi)滿足朗伯-比爾定律,因此選用分光光度法測(cè)定納米乳液中番茄紅素的量[14]。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確稱取2.1 mg番茄紅素標(biāo)品,以少量二氯甲烷溶解,加入正己烷定容至10 mL為1號(hào)母液。于1號(hào)母液中分別吸取10,50,100,500,1 000,2 000 μL 置于 6 個(gè) 10 mL 的容量瓶中,加正己烷至刻度,搖勻,即配成番茄紅素質(zhì)量濃度為 0.2,1.0,5.0,10.0,20.0,40.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以正己烷為參比,依次在472 nm下測(cè)其吸光度。
乳液中番茄紅素含量測(cè)定:取200 μL新制的番茄紅素乳液樣品與800 μL的DMSO均勻混合,然后依次加入2 mL的正己烷∶二氯甲烷的混合有機(jī)相(3∶1,V∶V)進(jìn)行萃取,重復(fù)萃取 3 次后合并萃取液,在3 000 r/min下離心10 min,取上層清液置于分光光度計(jì)下測(cè)定番茄紅素的吸光值。以正己烷作為空白對(duì)照,測(cè)定波長(zhǎng)為472 nm,結(jié)果通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。
1.5.2 番茄紅素的負(fù)載率 計(jì)算方程如 (1)式所示:
式中:C1——新鮮乳液中番茄紅素的質(zhì)量濃度,μg/mL;C0——均質(zhì)前加入番茄紅素的質(zhì)量濃度,μg/mL。
1.5.3 番茄紅素的保留率 計(jì)算方程如(2)式所示:
式中:C2——在儲(chǔ)藏時(shí)間t時(shí)乳液中番茄紅素的質(zhì)量濃度,μg/mL;C3——儲(chǔ)藏前乳液中番茄紅素的質(zhì)量濃度,μg/mL。
納米乳液的穩(wěn)定性分析通過(guò)Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)得。將新制納米乳液樣品放入20 mL的測(cè)量池內(nèi)進(jìn)行測(cè)量,每1 h掃描一次,比較分析樣品乳液組與空白乳液組在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。得到的掃描曲線為透射光和背散射光隨樣品高度的變化關(guān)系,反映了乳狀液內(nèi)部的微觀變化[15]。透射光和背散射光強(qiáng)度以%表示,通常,透射光用于分析透明樣品,而背散射光可用于分析乳液這類低透明度的樣品。
乳液的穩(wěn)定性還可以通過(guò)穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)指數(shù)TSI(Turbiscan Stability Index)來(lái)進(jìn)行表征,其定義如式(3):
式中:IBi(h)、IBi-1(h)分別為測(cè)量高度為 h 時(shí),第i次和第i-1次掃描背散射光強(qiáng),i=1時(shí),TSI定義為0;H為1至i次掃描時(shí)樣品高度的數(shù)值。TSI是樣品整體高度上在給定時(shí)間內(nèi)光強(qiáng)變化的絕對(duì)值加和,其數(shù)值越大,說(shuō)明樣品體系濃度或顆粒粒徑變化越大,體系越不穩(wěn)定[16]。
取一定量的新制番茄紅素納米乳液裝瓶,分別于(1)室溫(25℃),光照;(2)室溫,避光;(3)4℃,避光;(4)4℃,避光,充氮?dú)獾臈l件下靜置儲(chǔ)藏28d,每隔一周進(jìn)行取樣,測(cè)定乳液的粒徑及番茄紅素保留率的變化。
1.8.1 pH 穩(wěn)定性 配制 pH 為 2,3,4,5,6,7,8和9的磷酸鹽緩沖液,分別將200 μL新制的番茄紅素納米乳液稀釋100倍后,置于室溫平衡4 h,測(cè)定其粒徑及電位。
1.8.2 離子穩(wěn)定性 配制不同濃度的鹽離子溶液,其中NaCl濃度為0到1 mol/L,MgCl2濃度在0到0.016 mol/L,將200 μL新制的番茄紅素納米乳液用對(duì)應(yīng)的鹽溶液進(jìn)行稀釋100倍后,置于室溫平衡4 h,測(cè)定其粒徑及電位值。
1.8.3 蔗糖穩(wěn)定性 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0~16%的蔗糖溶液,將200 μL新制的番茄紅素納米乳液稀釋100倍后,置于室溫平衡4 h,測(cè)定其粒徑,并在600 nm處測(cè)其吸光值(濁度測(cè)量)。
所有試驗(yàn)都至少重復(fù)3次并采用平均值,采用Microsoft excel2016軟件進(jìn)行方差分析,試驗(yàn)數(shù)值間以 Duncan法(P<0.05)進(jìn)行差異顯著性分析。Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析儀采集數(shù)據(jù)使用Turbi Soft 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
納米乳液作為一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系,在儲(chǔ)藏的過(guò)程中會(huì)發(fā)生粒子的碰撞,顆粒之間相互聚集的現(xiàn)象影響著納米乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[17]。以空白乳液為對(duì)照,圖1為納米乳液體系的背散射光強(qiáng)度隨樣品高度的變化曲線。橫坐標(biāo)表示乳液樣品高度(底部高度為0),縱坐標(biāo)表示背散射光強(qiáng)度(BS),圖線的不同顏色反映了不同背散射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化而變化的情況。同時(shí)利用Turbiscan計(jì)算不同乳液的TSI指數(shù),以比較空白乳液和番茄紅素納米乳液的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。
從圖1可以看出,在觀察時(shí)間內(nèi),納米乳液發(fā)生了一定的由乳液內(nèi)部的水相濃度減小,分散相油相逐漸上浮脫出而引起的失穩(wěn),還伴隨著乳液整體的BS(%)隨時(shí)間的推移而增加(初始時(shí)為底部的藍(lán)色線條),表明乳液的粒徑在增大,這是奧斯特瓦爾德現(xiàn)象[18-19],即在拉普拉斯壓力差的作用下,分散相從小的液滴擴(kuò)散轉(zhuǎn)移至較大的液滴的現(xiàn)象??梢?jiàn)納米乳液作為一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,沉淀和奧氏熟化是導(dǎo)致其失穩(wěn)的主要原因。由圖2可以看出,隨著測(cè)試時(shí)間的延伸,納米乳液體系的TSI值緩慢增加,表明乳液在逐漸趨于不穩(wěn)定,但同時(shí)間點(diǎn)下番茄紅素納米乳液TSI值均高于作為對(duì)照的空白乳液,說(shuō)明番茄紅素載入后納米乳液體系的穩(wěn)定性有一定的影響,使得番茄紅素納米乳液較空白乳液更易不穩(wěn)定。
圖1 乳液△BS隨掃描時(shí)間和掃描高度的變化圖Fig.1 The change of△BS during scan procedure
圖2 乳液的TSI值的變化圖Fig.2 The change of the TSI during scan procedure
將制備的番茄紅素納米乳液分成4組,分別置于(1)室溫(25℃),光照;(2)室溫,避光;(3)4℃,避光;(4)4℃,避光,充氮?dú)獾臈l件下靜置儲(chǔ)藏28 d,并在一定的時(shí)間對(duì)乳液粒徑和番茄紅素保留率進(jìn)行測(cè)定,分析溫度、光照和氧氣等因素對(duì)納米乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響。
圖3 不同儲(chǔ)藏條件下番茄紅素納米乳液粒徑的變化Fig.3 Evolution of mean diameters of lycopene nanoemulsions over time upon different store conditions
2.2.1 儲(chǔ)藏過(guò)程中納米乳液的粒徑變化 從圖3可以看出,在所有的儲(chǔ)存條件下,乳液的粒徑均會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其中乳液在室溫下儲(chǔ)藏28 d后的粒徑增長(zhǎng)幅度最大,為20%左右,當(dāng)儲(chǔ)藏溫度下降至4℃時(shí),乳液表現(xiàn)出更好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性即更小的粒徑增加幅(12%)。相較于溫度對(duì)樣品粒徑的作用效果,光照和氧氣的作用則要小得多。從以上試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè),在儲(chǔ)藏溫度、光照和氧氣3種儲(chǔ)藏條件中,儲(chǔ)藏溫度是影響納米乳液穩(wěn)定性最為重要的參數(shù),其次是光照、氧氣。根據(jù)Tse K Y等[20]的研究,乳液在較高溫度下的不穩(wěn)定,可能是由于系統(tǒng)黏度的降低和分子較大的流動(dòng)性造成的。但是總體而言,在儲(chǔ)藏28 d內(nèi),所有乳液均無(wú)明顯的相分離或乳化分層現(xiàn)象發(fā)生。
2.2.2 納米乳液中番茄紅素在儲(chǔ)藏過(guò)程中保留率的變化 由于番茄紅素對(duì)外界環(huán)境極其敏感,因此,將乳液在不同條件下儲(chǔ)藏28 d,分別考察溫度、光照和氧氣對(duì)乳液中番茄紅素保留率的影響。對(duì)于每個(gè)不同的儲(chǔ)藏條件,溶解在MCT油相中的番茄紅素樣品被作為對(duì)照組,與乳液中番茄紅素的穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比。
結(jié)果如圖4所示,所有樣品中的番茄紅素保留率均隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加而減小。但在25℃、光照作用下靜置28d后,乳液中番茄紅素的保留率依然高于40%,相較對(duì)照樣品中的番茄紅素在2周內(nèi)就已完全消耗殆盡有著明顯的改善;而25℃下避光處理的乳液中番茄紅素保留率并沒(méi)有顯著降低,推測(cè)光照對(duì)番茄紅素的降解作用較小。在所有樣品中,在4℃、避光、充氮?dú)獾臈l件下儲(chǔ)藏28 d后的乳液番茄紅素保留率最大,為67%,比不充氮?dú)獾臉悠繁A袈矢叱?3%左右,而在同樣做避光處理的乳液中,4℃下儲(chǔ)藏樣品的保留率比25℃高9%。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè),氧氣是影響番茄紅素納米乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性最重要的因素,其次是溫度、光照。
圖4 不同儲(chǔ)藏條件下番茄紅素保留率的變化Fig.4 Retention of lycopene in nanoemulsions over time with different store conditions
負(fù)載番茄紅素的納米乳液作為一種功能組分運(yùn)輸體系,如果可以直接加入食品體系將會(huì)極大提高其應(yīng)用方便性[21]。當(dāng)納米乳液應(yīng)用于食品領(lǐng)域時(shí),需要經(jīng)受不同的加工條件、不同濃度的鹽離子以及蔗糖溶液,為了獲得各項(xiàng)穩(wěn)定性都良好的乳液體系,對(duì)所制備番茄紅素納米乳液進(jìn)行應(yīng)用穩(wěn)定性試驗(yàn),包括pH穩(wěn)定性試驗(yàn)、離子穩(wěn)定性試驗(yàn)以及蔗糖穩(wěn)定性試驗(yàn),來(lái)評(píng)價(jià)所構(gòu)建納米體系的應(yīng)用穩(wěn)定性。
2.3.1 pH穩(wěn)定性 將所構(gòu)建番茄紅素納米乳液添加到不同pH的磷酸鹽緩沖液中,測(cè)定其粒徑及電位值的變化情況,結(jié)果如表1所示。
表1 不同pH下納米乳液的粒徑和電位Table1 The mean particle size and zeta potential of nanoemulsions prepared with different pH
由表1可知,番茄紅素納米乳液的Zeta電位值的絕對(duì)值隨著pH的上升而遞增,粒徑則呈現(xiàn)先減小后增大的變化規(guī)律。樣品的酸堿穩(wěn)定性較強(qiáng),過(guò)酸和過(guò)堿都會(huì)造成納米乳液的穩(wěn)定性下降。綜合來(lái)看,番茄紅素納米乳液的耐酸性比較強(qiáng)。這是由于OSA變性淀粉為陰離子型生物大分子乳化劑,體系的pH值影響其解離,改變其在界面膜表面的吸附性能,進(jìn)而影響乳液的穩(wěn)定性[22]。在酸性條件下,H+很容易與OSA分子結(jié)構(gòu)中的RCOO-相互吸附,導(dǎo)致油水界面層表面電負(fù)性減弱,電位值減小,OSA分子間的靜電排斥效應(yīng)減弱,單個(gè)分子占有空間縮小,更多游離的OSA分子被吸附到界面處。在堿性條件下,隨著溶液pH值的增加,分子結(jié)構(gòu)中的R-COO-會(huì)不斷發(fā)生電離,乳液表面的電位值增大,有效功能基團(tuán)間較強(qiáng)的排斥效應(yīng)使OSA淀粉分子充分伸展,單個(gè)分子在油水界面所占有的空間范圍變大,此時(shí)界面膜的空間位阻效應(yīng)阻攔體系中自由態(tài)分子的進(jìn)一步吸附[23]??梢?jiàn),番茄紅素納米乳液在pH為3~6的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定,此時(shí)靜電排斥作用減弱,但強(qiáng)大的空間位阻作用保證了納米乳液粒徑的穩(wěn)定性;當(dāng)pH>7時(shí),界面膜的空間位阻效應(yīng)減弱,盡管靜電排斥作用增強(qiáng),卻不足以維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,乳液的粒徑增大。
2.3.2 離子穩(wěn)定性 電解質(zhì)是維持人體各項(xiàng)生命活動(dòng)的重要物質(zhì),具有調(diào)節(jié)肌肉收縮,保持酸堿平衡等重要作用。在食品和飲料產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中,通常需要添加離子來(lái)提供人體電解質(zhì)平衡,最常見(jiàn)的有Na+和Mg2+,將番茄紅素納米乳液在0~1.0 mol/L的NaCl溶液和0~0.016 mol/L的MgCl2溶液中的粒徑和電位值隨離子濃度的變化情況,結(jié)果如圖5和圖6所示。
從圖中可以看出,Na+和Mg2+的添加導(dǎo)致了乳液的電位值的絕對(duì)值顯著下降,然而不同濃度的NaCl和MgCl2并不會(huì)顯著影響納米乳液的粒徑,二者的乳液粒徑增長(zhǎng)幅度均不超過(guò)10%,結(jié)果與馮建國(guó)[24]在探究高分子化合物對(duì)氟蟲(chóng)脲水懸浮劑的穩(wěn)定性影響中得出的規(guī)律一致:電解質(zhì)的添加會(huì)降低電位值。這是因?yàn)橐設(shè)SA變性淀粉穩(wěn)定的納米乳液是通過(guò)油水界面層的靜電排斥作用和空間位阻作用來(lái)維持乳液的穩(wěn)定,電解質(zhì)離子添加后附著于油水界面層,壓縮界面層使其變薄,降低電位值。同時(shí),帶負(fù)電荷的R-COO-所產(chǎn)生的靜電排斥作用因被Na+和Mg2+屏蔽而減弱,軟化了分子結(jié)構(gòu),單個(gè)分子在油水界面所占有的空間范圍縮小,更多OSA分子吸附在乳液表面,體系的空間位阻效應(yīng)增強(qiáng),可以有效減緩乳液的凝聚。因此將番茄紅素納米乳液直接添加到食品體系中時(shí),食品體系中的鹽離子并不會(huì)影響其使用性能。
圖5 不同NaCl濃度下番茄紅素納米乳液的粒徑和電位值Fig.5 Influence of NaCl concentration on the mean particle size and zeta potential of lycopene nanoemulsions
圖6 不同MgCl2濃度下番茄紅素納米乳液的粒徑和電位值Fig.6 Influence of MgCl2concentration on the mean particle size and zeta potential of lycopene nanoemulsions
2.3.3 蔗糖穩(wěn)定性 目前有很多機(jī)制說(shuō)明蔗糖對(duì)乳化體系的穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用[25]:首先蔗糖增大了連續(xù)相的黏度,有效減少體系中乳液間發(fā)生相互撞擊的頻率[26];其次蔗糖會(huì)改變了納米乳液溶液的物理化學(xué)性質(zhì),改變排斥效應(yīng)強(qiáng)度,進(jìn)而減緩乳液間碰撞的頻率;最后,蔗糖溶液能降低連續(xù)相中氧含量,有助于減緩番茄紅素的氧化降解。配置濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%到18%的蔗糖溶液,研究其對(duì)番茄紅素納米乳液粒徑和吸光度的影響,結(jié)果如圖7所示。
圖7 蔗糖濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)番茄紅素納米乳液粒徑和吸光值的影響Fig.7 Influence of sucrose concentration mass fraction on the mean particle size and absorbance of lycopene nanoemulsions
可以看出,當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%上升至18%時(shí),體系中納米乳液的粒徑由151 nm增加到228 nm,增長(zhǎng)幅度達(dá)到50%,說(shuō)明蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液的粒徑影響顯著,這是因?yàn)檎崽欠肿訒?huì)同OSA變性淀粉分子的親水基團(tuán)相結(jié)合,致使粒徑的增大。而伴隨著蔗糖濃度的增大,吸光值變小,樣品的外觀變得更加透明,這有利于其在食品飲料體系中應(yīng)用[27]。綜上所述,食品飲料中蔗糖的濃度不僅不會(huì)影響番茄紅素納米乳液的穩(wěn)定性,還有利于提高其應(yīng)用效果。
本研究以食品級(jí)生物大分子辛烯基琥珀酸酯化淀粉為乳化劑,以MCT為油相,在高壓均質(zhì)的條件下制備負(fù)載番茄紅素納米乳液。采用Turbiscan AGS分析儀對(duì)體系穩(wěn)定性的檢測(cè)及分析發(fā)現(xiàn)納米乳液作為一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,沉淀和奧氏熟化是導(dǎo)致其失穩(wěn)的主要原因。進(jìn)一步比較乳液在不同外界條件下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn):溫度對(duì)乳液粒徑增長(zhǎng)的影響最為明顯,其次是光照和氧氣。而對(duì)番茄紅素保留率影響最顯著的條件是氧氣,其次是溫度和光照。番茄紅素納米在4℃避光充氮?dú)獾臈l件下儲(chǔ)藏1個(gè)月后,乳液粒徑從138 nm增加到157 nm,保留率為41%,遠(yuǎn)高于對(duì)照組,體現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。對(duì)番茄紅素納米乳液的應(yīng)用穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn),番茄紅素納米乳液的耐酸性較強(qiáng),鹽離子和蔗糖分子并不會(huì)對(duì)納米乳液結(jié)構(gòu)造成太大的影響。本研究對(duì)番茄紅素納米乳液穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明所構(gòu)建的納米乳液具有較好的穩(wěn)定性及在食品體系的應(yīng)用潛力,并為進(jìn)一步的穩(wěn)定機(jī)理研究提供數(shù)據(jù)支持。