楊佳，陳旻，李明花，欽敬茹，王中奇

0 引言

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，其中肺腺癌的比例占40%以上[1]，盡管不斷有新的治療方法出現(xiàn)，但五年總生存率仍在20%以下，這主要與其容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥的特性有關(guān)[2]。相較于化療藥的不良反應(yīng)，從天然中草藥中挖掘有效抗腫瘤成分已成為研發(fā)的熱點(diǎn)之一，具有很大的臨床價(jià)值[3]。

血根堿（sanguinarine,相對分子質(zhì)量367.8）是從中藥白屈菜、博落回、紫堇、血水草等植物中提取的苯菲啶喹啉類生物堿，具有抗菌消炎、殺蟲和麻醉等藥理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對宮頸癌[4]、胰腺癌[5]、肝癌[6]、胃癌[7]等多種腫瘤具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，但血根堿在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的報(bào)道尚少。我們前期已發(fā)現(xiàn)，血根堿可以抑制肺癌“干細(xì)胞”樣細(xì)胞[8]，而其對肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及分子調(diào)控均不明確。Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨c肺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[3,9]。

本研究旨在通過觀察血根堿對兩種不同人肺腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，進(jìn)一步探討其與Wnt/β-catenin信號通路之間的初步關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549、H1975（上海中科院細(xì)胞庫）;血根堿（Sigma公司,CAS號：S5890,HPLC≥98%，美國）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶-EDTA（Gibco公司，美國），青霉素/鏈霉素（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMSO（Sigma公司,美國）；Transwell小室、Matrigel膠（BD公司,美國）；cDNA試劑盒及Real-time PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；PVDF膜（Millipore公司，美國）；GSK3β、p-GSK3β（Ser9）、DVL2兔單克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體、二抗（兔和鼠）（Cell Signaling Technology（CST）公司，美國）；β-catenin兔單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549和H1975細(xì)胞用含10%FBS、100 μg/ml青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 藥物配制 血根堿用DMSO配成100 mmol/L的母液，分裝后-2 0 ℃存儲；使用前，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，DMSO終濃度＜0.1%。

1.2.3 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液以每孔2×104/ml的密度加到96孔板中，待細(xì)胞過夜貼壁后，用藥組分別加入10、5、2.5、1 μmol/L的血根堿，對照組加入同體積的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，用MTT法在490 nm波長處測吸光度值（OD）,計(jì)算增殖抑制率。

1.2.4 劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液以5×105/ml接種到6孔板中，待細(xì)胞過夜貼壁長至80%后棄培養(yǎng)液，用200 μl槍頭在6孔板正中劃一條直線，PBS清洗3次后，換入含1 μmol/L血根堿濃度的完全培養(yǎng)基作用48 h；同時(shí)設(shè)空白對照組于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠和無FBS培養(yǎng)基按1:6混勻成70 μl，平鋪于小室底部孵育4 h；用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基將細(xì)胞按每孔1×106/ml密度接種于Transwell小室上層，分別加入含0、1 μmol/L濃度血根堿的完全培養(yǎng)基100 μl；下室每孔加入500 μl含20%FBS培養(yǎng)基，作用48 h后取出。用棉簽擦去上層細(xì)胞，乙醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，清水漂洗3次，于顯微鏡下取中央?yún)^(qū)隨機(jī)5個(gè)視野拍照，計(jì)算浸潤細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 RT-qPCR檢測Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因 將細(xì)胞懸液按1×106/ml密度接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、1、2.5 μmol/L血根堿作用6 h，用TRIzol法提總RNA并測定濃度，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR試劑盒說明書操作，以GAPDH作為內(nèi)參基因，應(yīng)用Thermal熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）檢測mRNA表達(dá)水平。用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，引物序列如下：β-catenin上游：5’-AGATGCAGCAACTAAACAGGA-3’，下游：5’-GTACTACATTTTAAGCCATCT-3’;GSK3β上游：5’-AACTGCCCGACTAACAACAC-3’，下游：5’-ATTGGTCTGTCCACGGTCTC-3’;LRP6上游：5’-TTGTTGCTTTATGCAAACAGACG-3’，下游：5’-CGTTTAATGGCTTCTTCGCTGAC-3’;DVL2上游：5’-GAGGAAGAGACTCCCTACCTG-3’，下游：5’-CGGGCGTTGTCATCTGAAAT-3’;TCF/LEF上游：5’-AGGAACATCCCCACACTGAC-3’，下游：5’-AGGTCTTTTTGGCTCCTGCT-3’;CyclinD1上游：5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3’，下游：5’-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3’;GAPDH上游：5’-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。

1.2.7 Western blot檢測Wnt/β-catenin通路核心蛋白 收集經(jīng)血根堿0、1、2.5、5 μmol/L作用6 h后的細(xì)胞，RIPA裂解后提取總蛋白，用BCA法定量；每個(gè)樣品取25 μg蛋白上樣，12%SDAPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用1%BSA封閉1 h，加入一抗（β-catenin、GSK3β、p-GSK3β（Ser9）、DVL2）4℃過夜孵育（1:1 000），二抗（1:1 000）孵育1 h，TBST漂洗3次后，化學(xué)發(fā)光劑ECL曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血根堿抑制A549和H1975細(xì)胞增殖

隨著血根堿濃度的增加，對A549和H1975細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)（均P＜0.05）；在同一濃度下，隨著作用時(shí)間的延長細(xì)胞活力也逐漸下降（均P＜0.05），呈一定的濃度-時(shí)間依賴性，見表1。24 h時(shí)血根堿對A549和H1975細(xì)胞的IC50分別為4.41和2.37 μmo/L。

表1 血根堿對A549及H1975細(xì)胞增殖的抑制作用 (,n=3)Table 1 Inhibitory effect of sanguinarine on proliferation of A549 and H1975 cells (,n=3)

表1 血根堿對A549及H1975細(xì)胞增殖的抑制作用 (,n=3)Table 1 Inhibitory effect of sanguinarine on proliferation of A549 and H1975 cells (,n=3)

Notes:*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001,compared with 0μmol/L group (Blank group);SAN:sanguinarine.

2.2 血根堿抑制A549和H1975細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，相較于空白對照組，血根堿在低濃度1 μmol/L作用48 h后，A549和H1975細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，見圖1。

2.3 血根堿抑制A549和H1975細(xì)胞侵襲

與空白對照組比，血根堿在低濃度1 μmol/L作用48 h后，可顯著減少A549和H1975細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002,P=0.001），見圖2。

2.4 血根堿抑制A549和H1975細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達(dá)

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，血根堿在1、2.5 μmol/L濃度下作用6 h后，Wnt/β-catenin通路中主要基因β-catenin、LRP6、DVL2及其下游靶基因TCF/LEF、CyclinD1的mRNA水平均有不同程度的下降（P＜0.05,0.01,0.001），呈一定的劑量依賴性；GSK3β在基因水平未見明顯改變（P＞0.05），見圖3。

2.5 血根堿下調(diào)A549和H1975細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白表達(dá)

與空白對照組比較，血根堿在1、2.5、5 μmol/L濃度下作用6 h后，可以顯著下調(diào)A549和H1975細(xì)胞Wnt/β-catenin通路中核心蛋白β-catenin、磷酸化GSK3β、DVL2表達(dá)，呈一定濃度依賴性；總GSK3β蛋白水平無明顯變化，見圖4。

3 討論

圖1 血根堿對A549和H1975細(xì)胞遷移作用的影響 (×100)Figure 1 Effect of sanguinarine on migration ability of A549 and H1975 cells (×100)

圖2 血根堿對A549和H1975細(xì)胞侵襲作用影響 (×200)Figure 2 Effect of sanguinarine on invasion ability of A549 and H1975 cells (×200)

圖3 血根堿對A549和H1975細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 3 Effect of sanguinarine on mRNA expression of Wnt/ β-catenin signaling pathway in A549 and H1975 cells

血根堿主要存在于中藥白屈菜、博落回的全草和紫堇的塊根中，近年來，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了其不同的抗癌作用。通過產(chǎn)生活性氧（ROS）激活線粒體凋亡途徑，血根堿可以促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞[10]、乳腺癌MCF-7細(xì)胞[11]、頭頸癌細(xì)胞[12]和肝癌HepG2細(xì)胞等的凋亡[6]。其中，也不乏關(guān)于對肺癌的報(bào)道，Xu等[13]發(fā)現(xiàn)血根堿可以抑制VEGF起到抗肺癌血管生成的作用；通過生成活性氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]，或調(diào)控外源性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TRAIL）[15]，或上調(diào)Fas相關(guān)因子的表達(dá)[16]，可以起到誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖的作用。除了抵抗增殖、誘導(dǎo)凋亡外，近期研究發(fā)現(xiàn)血根堿在抵抗多種腫瘤細(xì)胞耐藥、增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療藥的敏感度上也有很強(qiáng)作用[17-18]。Ma等[19]還發(fā)現(xiàn)血根堿可以通過Hedgehog-Gli-Nanog通路，抑制胰腺癌干細(xì)胞增殖和自我更新。我們前期也發(fā)現(xiàn)血根堿可以抑制體內(nèi)外肺癌“干細(xì)胞”樣細(xì)胞增殖[8]。然而，血根堿對肺腺癌細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究尚少，且分子機(jī)制尚不明確。

圖4 血根堿對A549和H1975細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白表達(dá)影響Figure 4 Effect of sanguinarine on β-catenin,GSK3β,pGSK3β and DVL2 in A549 and H1975 cells

本研究首先通過增殖實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了血根堿對A549和H1975細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且呈濃度-時(shí)間依賴性。劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血根堿在低劑量1 μmol/L濃度下，可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這一結(jié)果與徐加英等[4]在宮頸癌細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)一致。由β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt通路在肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用，當(dāng)細(xì)胞外Wnt配體與膜上受體Frizzled結(jié)合后，激活相鄰的LRP5/6蛋白，將信號傳遞到第二信使DVL；活化的DVL抑制由Axin、APC和GSK3β所組成的復(fù)合物活性，抑制β-catenin的磷酸化；磷酸化的β-catenin通過泛素化被胞質(zhì)內(nèi)的蛋白酶體降解而不入核；非磷酸化的β-catenin不被降解，從而導(dǎo)致在胞質(zhì)內(nèi)聚集，并向核內(nèi)移動，從而與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)下游靶基因c-myc、survivn、Cyclin-D1、MMP-7/9等表達(dá)[20-22]。

因此，β-catenin可視為檢測Wnt通路是否激活的一個(gè)核心指標(biāo)；LRP5/6、DVL、GSK3β作為調(diào)控β-catenin的關(guān)鍵上游因子；TCF/LEF、cyclin-D1作為β-catenin重要的下游靶基因，我們通過RT-qPCR和Western blot法對通路中這些關(guān)鍵分子的mRNA及蛋白水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，血根堿可以下調(diào)DVL2和GSK3β第9位絲氨酸磷酸化表達(dá)，盡管GSK3β表達(dá)無明顯改變，而GSK3β第9位絲氨酸的磷酸化降低意味著GSK3β催化活性的增加，從而促進(jìn)β-catenin降解，進(jìn)而抑制下游TCF/LEF、cyclin-D1表達(dá)，由此起到抑制肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血根堿可以有效抑制A549和H1975細(xì)胞增殖及遷移、侵襲，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。本研究初步揭示了血根堿抗肺腺癌遷移侵襲的分子機(jī)制，為血根堿進(jìn)一步臨床的開發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)支持。至于血根堿對Wnt信號的具體轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)以及血根堿是否會通過不同通路調(diào)控肺癌的其他表型作用尚待進(jìn)一步研究。