劉玟妍，陳思秀，王天添，段思琪，艾金霞，王艷雙，孫麗媛，*

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013）

肉及肉制品是人類的營養(yǎng)必需品，滿足人體26%的蛋白質(zhì)和13%的能量需要[1]。金萍等[2]檢驗涉及32個生產(chǎn)單位的90 份樣品，總不符合率為25.6%（23/90），主要以豬肉、鴨肉部分代替牛肉和羊肉；唐穗平等[3]抽樣調(diào)查的50 份市售肉類制品中20%摻假，摻假源為雞、鴨、豬3 種肉類。這些問題的出現(xiàn)嚴重干擾了我國畜肉產(chǎn)業(yè)，制約了肉品質(zhì)量的提升，并嚴重損害了消費者的權(quán)益。國家標準GB2760-2014《食品添加劑使用標準》[4]明確說明了食品添加劑的使用原則，食品添加劑不得掩蓋食品腐敗變質(zhì)，不得掩蓋食品本身或者加工過程中的質(zhì)量缺陷，不得以摻雜、摻假、偽造為目的而使用等。由于無法直接通過肉眼和味覺鑒別，因此，亟待建立一種特異性高、靈敏度強、高效快速的方法鑒別肉類產(chǎn)品中的鴨源性成分。

傳統(tǒng)肉類鑒別方法主要依賴于形態(tài)學(xué)檢驗。但形態(tài)學(xué)檢驗具有局限性，屬于主觀判斷，缺乏客觀技術(shù)指標，準確性欠佳，不適用于肉類加工產(chǎn)品的鑒別。目前，國內(nèi)外開展肉種鑒別的方法主要包括基于代謝物的拉曼散射光譜和紅外吸收光譜技術(shù)[5-7]、基于抗體抗原的酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)[8-9]、基于核酸的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[10-11]等。拉曼光譜的靈敏度較低，待測物需要較高的含量才可檢測。近紅外光譜法需要大量有代表性且測量值已知的樣品建立模型，但模型不通用限制它的使用范圍[12]。ELISA 技術(shù)容易受制于抗體的制備，加工過程蛋白質(zhì)變性，復(fù)雜基質(zhì)導(dǎo)致假陽性[13]。DNA 比蛋白質(zhì)的耐熱性強，高溫處理過的肉類中仍能提出片段化的DNA，而且DNA 比蛋白質(zhì)具有更豐富的種間多態(tài)性，更有利于物種鑒別[14]。近幾年新興的電子鼻和電子舌技術(shù)[15-17]雖然具有操作方便、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但分析過程復(fù)雜，不適用于無相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員檢測。因此，PCR方法的應(yīng)用更為廣泛，也是現(xiàn)行國家和行業(yè)標準中指定的主要方法之一，其操作簡便，可實現(xiàn)定性檢驗和高通量篩選。目前應(yīng)用于動物源性成分鑒別的PCR 方法包括實時熒光定量PCR（real-time PCR）[18-19]技術(shù)、數(shù)字PCR 技術(shù)[20-21]等。但此類技術(shù)所需的儀器及配件產(chǎn)品價格昂貴，過程較為復(fù)雜，對試驗操作要求較高，這些不足限制了將此研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為常見肉類產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的可能性。

由于動物的線粒體DNA 種屬特異性強，且在同一個體的不同組織無差異[22]，同時線粒體DNA 在每個細胞中都存在高拷貝數(shù)，即使肉品經(jīng)高溫等深加工處理后仍能被檢出，因此常被作為分子標記的靶基因[23]。本研究以鴨及其他常見動物（牛、羊、豬、雞、驢）的Cyt-B基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計并篩選特異性引物，應(yīng)用PCR 技術(shù)對肉制品中鴨源性成分進行檢測并克隆構(gòu)建了目的基因的重組質(zhì)粒，為肉類產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的研發(fā)提供了試驗基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗用鴨、牛、羊、豬、雞、驢6 種生鮮肉由長春食品藥品檢測中心提供及本地市場購買。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

Q6000 核酸蛋白分析儀：美國Quawell；9700 型PCR 擴增儀：美國ABI 公司；JY-600C 型雙穩(wěn)定時電泳儀：北京市君意東方電泳設(shè)備有限公司；UVWHITE-2020D 紫外凝膠成像自動分析儀：美國Cold Spring 公司；GL-20G-Ⅱ型變速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；JD100-3B 電子天平：沈陽龍騰電子有限公司。

1.2.2 主要試劑

Tris-HCl：GENVIEW；10 %十二烷基硫酸鈉：BIOSHARP；飽和乙酸鈉溶液：天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站；異丙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；70%冰凍酒精：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix、100 bp Ladder Marker：天根生化科技（北京）有限公司。

吉林省中藥DNA 指紋檢測技術(shù)科技創(chuàng)新中心實驗室自行研制改良十二烷基硫酸鈉法動物組織DNA提取試劑盒P1～P7（P1～P3 是細胞消化液，P4～P5 是DNA 沉淀劑，P6 是DNA 洗滌劑，P7 是DNA 溶解液）。

2 方法

2.1 PCR 引物設(shè)計

從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲取鴨、牛、羊、豬、雞、驢物種的Cyt-B 基因序列；采用DNAStar 等相關(guān)軟件進行序列比較，找出同源性較高的區(qū)域[24]，在該區(qū)域內(nèi)選擇引物設(shè)計的模板；使用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物；最后用BLAST 進行比對。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。特異性引物序列見表1。

表1 特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers

2.2 改良十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）堿變性法[25]提取DNA

高質(zhì)量DNA 的快速提取是決定分子生物學(xué)試驗成敗的關(guān)鍵因素。常規(guī)SDS 法不能很好地將雜質(zhì)去除干凈，影響后續(xù)的分子生物學(xué)試驗結(jié)果。故本實驗室（吉林省中藥DNA 指紋檢測技術(shù)科技創(chuàng)新中心）自行研發(fā)了改良SDS 法動物組織DNA 提取試劑盒，具體操作步驟如下：

將試驗樣品進行分類標記，取50 mg 左右樣品放入無菌EP（eppendorf）管中，加約1 mL 冷生理鹽水溶液浸泡20 min，去除生理鹽水，再浸泡，可反復(fù)2 次～3 次；然后盡量去除生理鹽水，用小型組織勻漿機點式研磨（上述操作盡量在冰盒上進行，以防止DNA 降解）。4 ℃，10 000r/min 離心5 min，棄上清液。取處理樣品20 mg，置于離心管中；加入P1 溶液500 μL，P2 溶液30 μL，P3 溶液15 μL 混勻，置于56 ℃水浴振蕩1 h；取出后加入P4 溶液500 μL，充分混勻10 min，10 000r/min 離心10 min；取上清液加入等體積P5 溶液，-20 ℃放置1 h；10 000 r/min 離心10 min；棄上清液，沉淀中加入P6 溶液200 μL，混勻，11 000 r/min 離心10 min，重復(fù)離心1 次；棄上清液，沉淀室溫（25 ℃）晾干后，加入P7 溶液100 μL 溶解DNA，輕輕混勻，作為試驗樣本DNA 儲存液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肉樣DNA 基因組濃度和純度檢測

DNA 鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260 nm 處，當(dāng)DNA 樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA 吸光度的準確測定。用核酸測定儀分別測定各個樣品的OD260、OD280，計算其比值衡量樣品的純度，每個樣品重復(fù)測定3 次。將得到的DNA 原液稀釋到約100 ng/μL，-20 ℃保存。

2.4 確立PCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上下游引物（10 ng/μL）各0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，二次蒸餾水8.5 μL，共20 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測

制備1.5%的瓊脂糖凝膠（瓊脂糖1.2 g，1×Tris-硼酸緩沖液80 mL），待所有瓊脂糖均完全融化，液體澄清，加入GelRed 7 μL。膠冷卻后4 μL 點樣。在電壓85 V，電流60 mA 的條件下電泳80 min。

2.6 特異性試驗

為了檢驗各引物PCR 特異性，在一批次PCR 反應(yīng)中同時對目標物種和其他參考物種進行檢測。一組加入鴨、牛、羊、豬、雞、驢模板及各自引物作為陽性對照組（引物及模板量提升至1 μL，以二次蒸餾水補齊至20 μL），另一組加入鴨、牛、羊、豬、雞、驢模板及所設(shè)計的鴨特異性引物作為試驗組。同時將鴨肉與牛肉1 ∶1 質(zhì)量比混合提取DNA、鴨肉與羊肉1 ∶1 質(zhì)量比混合提取DNA 制備鴨?；旌夏Ｐ秃网喲蚧旌夏Ｐ停c前文方法相同設(shè)立對照組和試驗組。瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.7 靈敏度試驗

檢測體系的靈敏度是指該檢測體系可以進行穩(wěn)定檢測的最低質(zhì)量濃度。本試驗將制備的鴨肉樣的DNA 模板（100 ng/μL）倍比稀釋，依次為1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5ng/μL，每個稀釋度各取2 μL 作為模板進行PCR 擴增，同時以雙蒸水代替DNA 模板設(shè)置陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.8 PCR 產(chǎn)物克隆

凝膠回收：切取特異性試驗得到的瓊脂糖凝膠中鴨的條帶（對照組及試驗組），稱取重量為0.398 g，使用TIANgel Midi Purification Kit（普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒）對樣本進行凝膠回收。由于后續(xù)做測序，即使用二次蒸餾水做洗脫液，并用核酸測定儀測定提取的樣品DNA 濃度，鴨為8.8 ng/μL。

質(zhì)粒連接：使用pGM-T 連接試劑盒對樣品進行質(zhì)粒連接。根據(jù)所測得的樣品濃度及分子量大小計算PCR 純化產(chǎn)物的加入量為4 μL。計算公式如下：

PCR 純化產(chǎn)物的加入量/μL=200×bp 數(shù)/3015×濃度（凝膠回收DNA）

克隆轉(zhuǎn)化：將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到DH5α 感受態(tài)細胞中，加入SOC 培養(yǎng)基增菌，將菌液滴加于LB 固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)菌液平板16 h。

藍白斑篩選，提質(zhì)粒：挑取白色菌落進行細菌增菌，使用TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒對樣本進行質(zhì)粒提取。由于后續(xù)做測序，即使用二次蒸餾水做洗脫液，并用核酸測定儀測定提取的質(zhì)粒的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 肉樣DNA 基因組濃度和純度檢測

不同物種的DNA 純度與濃度結(jié)果見表2。

表2 不同物種的DNA 純度與濃度Table 2 Purity and content of DNA from different samples

肉樣DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，DNA濃度在140 ng/μL～370 ng/μL 之間。

3.2 特異性試驗

應(yīng)用設(shè)計的鴨特異性引物進行試驗，鴨引物PCR特異性擴增結(jié)果見圖1。

圖1 鴨引物PCR 特異性擴增結(jié)果Fig.1 PCR specificity amplification of the primers for duck

由圖1 可知，僅鴨肉DNA 模板能擴增出大小為512 bp 的目的片段，其余肉類樣本DNA 模板擴增均為陰性。

鴨?；旌夏Ｐ蚉CR 特異性擴增結(jié)果見圖2。

圖2 鴨?；旌夏Ｐ蚉CR 特異性擴增結(jié)果Fig.2 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and cattle

由圖2 可知，鴨肉與牛肉DNA 模板均擴增出大小為512 bp 和256 bp 目的片段。

鴨羊混合模型PCR 特異性擴增結(jié)果見圖3。

圖3 鴨羊混合模型PCR 特異性擴增結(jié)果Fig.3 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and sheep

由圖3 可知，鴨肉與羊肉DNA 模板均擴增出大小為512 bp 和317 bp 目的片段。

3.3 靈敏度試驗

將制備的鴨肉DNA 模板用二次雙蒸水10 倍梯度稀釋，得質(zhì)量濃度0.000 001 ng/μL～100 ng/μL，取2 μL為模板。鴨源性DNA 靈敏度檢測結(jié)果見圖4。

圖4 鴨源性DNA 靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of duck derived DNA

由圖4 可知，PCR 擴增后，當(dāng)反應(yīng)體系中含鴨源性DNA 成分0.000 01 ng/μL 時，可觀察到目的條帶。

3.4 克隆結(jié)果測序分析

克隆質(zhì)粒PCR 電泳結(jié)果見圖5。

圖5 克隆質(zhì)粒PCR 電泳結(jié)果Fig.5 PCR electrophoresis of cloning plasmid

由圖5 可知，克隆結(jié)果與預(yù)期目的條帶位置一致。

鴨特異性基因片段克隆產(chǎn)物測序比對結(jié)果見圖6。

由圖6 可知，目的片段經(jīng)測序后，在NCBI 上BLAST 結(jié)果表明該片段的核苷酸序列與GeneBank 中已登記的鴨物種（EU755253.1）相似性均為100%，證明所得克隆的DNA 片段即為目的基因片段。

圖6 鴨特異性基因片段克隆產(chǎn)物測序比對結(jié)果Fig.6 Sequencing comparison results of cloned products of duck specific gene fragment

4 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)Cyt-B 基因中的保守序列設(shè)計鴨的特異性引物，擴增片段大小為512 bp，優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，確定退火溫度，PCR 結(jié)果通過凝膠電泳成像系統(tǒng)進行顯現(xiàn)。特異性試驗中僅有以鴨的DNA 為模板擴增出了特異性條帶，其他肉類均無相應(yīng)條帶，結(jié)果為陰性，混合模型的特異性試驗同時擴增出了鴨與混合其他肉種樣品的特異性條帶，表明設(shè)計的引物特異性強，能夠檢測出肉制品中鴨源性成分。目前用于動物源性成分檢測的PCR 方法都十分敏感，DNA 檢測的靈敏度達到了pg 級[26]，本檢測體系可以對鴨肉含量為1 pg 的肉制品實現(xiàn)穩(wěn)定檢測，與范麗麗等[27]建立的針對豬肉熒光PCR 檢測體系靈敏度（1 pg）及許如蘇等[28]建立的針對4 種動物多重?zé)晒釶CR 檢測體系靈敏度（0.01%）結(jié)果相同。目前，本研究正應(yīng)用于市售牛、羊肉樣品中鴨源性成分摻假的檢測。

為了使分子生物學(xué)方法鑒定肉類真?zhèn)卧诨鶎訌V泛推廣，須有穩(wěn)定的陽性對照品。非官方購買的樣品需鑒定真?zhèn)?，而長期從食品藥品監(jiān)督局購買陽性對照品又會造成經(jīng)濟負擔(dān)，且肉類容易變質(zhì)，不利保存。本研究克隆構(gòu)建了目的基因的重組質(zhì)粒，測序分析結(jié)果表明克隆的特異性基因序列與Genbank 中相同物種（序列ID：EU755253.1）核苷酸同源性達100%，可作為陽性對照用于鑒定動物源性產(chǎn)品中鴨肉成分，同時也為常見肉類產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。