徐 冉, 黃 虹, 袁建梅, 劉海容, 李風亭

(1. 同濟大學 環(huán)境科學與工程學院, 上海 200092; 2. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院, 上海 200092)

除蟲菊是一種多年生草本菊科植物,其花朵中可提取出天然除蟲菊酯并用以制成各種殺蟲產品[1].天然除蟲菊酯對溫血動物毒性極低[2],對昆蟲擊倒速度快[3],在環(huán)境中及動物體內無殘留,已被廣泛應用了100多年而沒有出現抗性報道, 被認為是最為安全和有效的天然殺蟲劑[4].然而除蟲菊酯易被陽光、空氣、較高的溫度及金屬離子分解,這種不穩(wěn)定性使天然除蟲菊酯類產品在生產及儲存過程中有效成分含量不斷損失,影響殺蟲效力,而且作用的持效性短,導致施藥成本增加[5].

目前天然除蟲菊酯大多采取原藥稀釋制備成乳油、水乳劑等的乳液形式進而應用,但除蟲菊酯的環(huán)境不穩(wěn)定性會導致持效性短、施藥成本增加.也有研究報道將除蟲菊酯制備成納米微膠囊進行應用,但所用壁材多為甲基丙烯酸甲酯和苯乙烯,材料存在毒性或致癌性,且工藝復雜、制備成本高[6-7].而關于天然除蟲菊酯微膠囊的應用卻鮮有研究報道.

微膠囊技術具有延長芯材存放時間,防止被空氣氧化,掩蓋芯材不良氣味等功效[8].這種技術的優(yōu)勢在于形成微膠囊時,芯材被包裹并與外界環(huán)境隔離,而它的性質能被毫無影響地保留下來[9];并在適當的條件下,如壓力、pH值、酶、溫度等可以完全釋放出來[10-11].

β-環(huán)糊精(β-CD)是由7個吡喃型葡萄糖分子以α-1,4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物,其外形呈圓臺狀,親水性基團分布在表面形成親水區(qū),而內部的中空部位則分布著疏水性基團形成疏水區(qū),疏水中心可與許多物質形成包接配合物并置于中心部位而完成包合過程.其分子結構及立體結構如圖1所示.

敖慧君等[12]以β-環(huán)糊精為壁材對維生素E進行微膠囊化,成功解決了維生素E易氧化、光熱不穩(wěn)定的問題.Ayala-Zavala等[13]利用β-環(huán)糊精制備了以肉桂精油和大蒜精油為芯材的抗菌劑微膠囊,改善了肉桂精油和大蒜精油易揮發(fā)的特性,為其更好地應用在食品工業(yè)中奠定基礎.

本研究旨在使用經濟、環(huán)保、無毒的β-環(huán)糊精為壁材,制備天然除蟲菊酯微膠囊,并對微膠囊進行性能表征和應用研究.微膠囊化有助于延長天然除蟲菊酯的持效期,減少施藥次數和頻率,從而提高農藥的利用率,對于微膠囊劑的制備和使用推廣具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

本研究采用從國藥集團化學試劑有限公司采購的β-環(huán)糊精作為微膠囊的壁材,芯材為森菊發(fā)展肯尼亞有限公司提供的除蟲菊酯原液,本研究所用的其他化學試劑均為分析純級.

實驗儀器有:恒溫磁力攪拌器(DF-101D,鞏義市予華儀器有限責任公司);真空干燥箱(DZF-6020,上海精宏試驗設備有限公司);超聲細胞破碎儀(SY-300,上海寧商超聲儀器有限公司);掃描電子顯微鏡(SEM,XL-30E,荷蘭Philips公司);綜合熱分析儀(Q600 SDT,美國TA公司);傅里葉變換紅外光譜儀(BRUKER VECTOR 22,瑞士Bruker公司);氣相色譜-質譜儀(GCMS-QP 2010SE,日本島津公司);馬爾文激光粒度分析儀(Mastersizer 3000,英國馬爾文儀器有限公司)等.

1.2 微膠囊的制備與表征

根據徐冉等[14]的方法制備以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊.稱取1 g的天然除蟲菊酯原液溶解分散于5 mL乙醇中,再稱取9 g的β-環(huán)糊精倒入100 g水中,70 ℃水浴攪拌,待完全溶解后,將已經完全分散的芯材溶液倒入β-環(huán)糊精溶液中,并降低溫度至55 ℃,繼續(xù)水浴攪拌包合4 h后,包合形成的微膠囊慢慢以沉淀析出.調節(jié)溫度至43 ℃繼續(xù)保溫固化16 h.反應結束后,抽濾,50 ℃烘箱干燥24 h,得到包埋率(囊壁包裹的芯材占微膠囊總除蟲菊酯含量的百分比)為92.15%、載藥率(芯材占微膠囊總質量的百分比)為8.5%、粒徑范圍為1~17 μm的固體天然除蟲菊酯微膠囊.粒徑在1~40 μm之間,符合農藥微膠囊的應用要求[15].反應機理如圖2所示.圖中,R、R′表示除蟲菊酯分子結構中相連的不同烷基.

圖2 包合法制備天然除蟲菊酯微膠囊機理圖

采用氣相色譜法對天然除蟲菊酯原藥及所制備微膠囊進行定性定量分析.采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM),對樣品在氮氣保護下進行表面噴金后在3.0 kv的掃描電壓下觀察其表面形貌.采用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared, FTIR),用KBr壓片法對所制備的微膠囊進行官能團測定.

1.3 微膠囊的應用研究

對所制備的微膠囊進行應用研究,包括熱穩(wěn)定性分析、緩釋性能測定、儲存穩(wěn)定性測定、作用時長分析及蚊蟲的毒性實驗研究.

利用綜合熱分析儀測定微膠囊的熱穩(wěn)定性,取10~15 mg干燥微膠囊粉末于氧化鋁坩堝內,測量樣品在N2氛圍下,10 ℃·min-1的升溫速度時, 50~600 ℃溫度范圍內的質量損失百分比.

參照Fan等[16]、周明松等[17],以透析袋法測定微膠囊的緩釋性能.稱取除蟲菊酯原藥或微膠囊粉末于盛有3 mL釋放介質(乙腈和超純水體積比為1:1的混合溶液)的透析袋中(截留分子量為7 000 g·mol-1),將袋口密封后放入裝有150 mL釋放介質的燒杯中,置于恒溫搖床中以100 r·min-1振蕩.每隔一定時間取1 mL燒杯中的釋放介質,測定其中天然除蟲菊酯濃度,再補充1 mL釋放介質;則可計算并繪制出天然除蟲菊酯累積釋放量-時間的緩釋曲線.

將制備好的微膠囊粉末裝入密封袋中,避光儲存在4 ℃冰箱,隔一段時間后,通過掃描電鏡觀察其形貌的變化,通過測定載藥率得出其芯材的損失量,從而判斷微膠囊的儲存穩(wěn)定性.

測試以β-環(huán)糊精為壁材的微膠囊分別對淡色庫蚊和白紋伊蚊幼蟲、二化螟幼蟲、粘蟲(3齡初期幼蟲)的毒力(試蟲均取自于上海南方農藥研究中心),24 h后記錄試蟲的死亡數,實驗重復2次,并進行統(tǒng)計分析.

2 結果與討論

2.1 氣相色譜分析

采用氣相色譜法,用乙醇洗去微膠囊表面未被包埋的除蟲菊酯后,在200 Hz的超聲細胞破碎儀中超聲5 min破囊,而后將樣品進行氣相色譜測定和定性定量的分析.色譜圖中可觀察到如圖3所示除蟲菊酯的6個特征峰,說明微膠囊制備成功,天然除蟲菊酯存在于微膠囊的內部空腔結構.

1-除蟲菊素Ⅰ 2-瓜葉菊素Ⅰ 3-茉酮菊素Ⅰ 4-瓜葉菊素Ⅱ 5-茉酮菊素Ⅱ 6-除蟲菊素Ⅱ

圖3 氣相色譜圖

Fig.3 Gas chromatogram

所制備的微膠囊包埋率為92.15%,載藥率為8.5%,其中未被壁材包埋、附著在微膠囊表面的芯材,雖然不能起到緩慢釋放的作用,但可以作為即時藥效,和被包埋的芯材共同結合起到瞬時及緩釋二合一的作用.理論載藥率為10%,而實際制備的微膠囊載藥率為8.5%,未結合在固體微膠囊中,即仍在乳液中的除蟲菊酯可以作為瞬時藥效直接噴灑應用.

2.2 SEM分析

圖4為以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊的掃描電鏡圖,其中圖4a、4b的放大倍數分別為2 000倍和7 000倍.通過SEM圖可以看出,微膠囊保留了β-環(huán)糊精的近似菱形結構,天然除蟲菊酯進入β-環(huán)糊精的疏水空腔部分形成微膠囊.雖然微膠囊的表面形貌沒有太大變化,但根據氣相色譜和紅外光譜等的定性分析,均可得出除蟲菊酯已被成功包埋.說明除蟲菊酯與β-環(huán)糊精的疏水性結構相結合并存在于其內部的空腔結構中,因而未對壁材的表面形貌產生影響.

a 放大2 000倍

b 放大7 000倍

2.3 FTIR分析

圖5為以β-環(huán)糊精為壁材的微膠囊的紅外光譜圖,其中1、2和3圖線分別代表天然除蟲菊酯原藥、空白微膠囊和天然除蟲菊酯微膠囊的紅外譜圖.對比圖線1和2可見,圖線1在1 717 cm-1處的吸收峰是酯類C=O伸縮振動的特征峰,來自天然除蟲菊酯的酯基官能團;圖線2在1 257 cm-1和1 376 cm-1處的中等強度的峰為O-H的彎曲振動,3 332 cm-1處有一個寬且較強的峰,為-OH的伸縮振動吸收峰.對比圖線2和3可見,圖線3在1 719 cm-1處出現了新的天然除蟲菊酯的特征峰,且在2 923cm-1處的吸收峰出現增強,也說明是除蟲菊酯和β-環(huán)糊精的疊加,證明了天然除蟲菊酯成功進入β-環(huán)糊精的疏水空腔.

1-天然除蟲菊酯 2-空白微膠囊 3-天然除蟲菊酯微膠囊

2.4 熱穩(wěn)定性分析

圖6為以β-環(huán)糊精為壁材的微膠囊熱重分析曲線.其中 圖6a為樣品隨著溫度升高的熱分解過程,即熱重分析(thermal gravity analysis, TG)曲線.圖6b為TG曲線對溫度的一階導數,以樣品的質量變化速率對溫度作圖,即DTG(differential thermal gravity)曲線.曲線1、2和3分別是天然除蟲菊酯、空白微膠囊和除蟲菊酯微膠囊的曲線.

從圖中可看出天然除蟲菊酯共有三個階段的質量損失: 130℃之前出現的2%~15%的質量損失是由樣品中少量殘余的水分揮發(fā)引起的,天然除蟲菊酯在130℃~200℃之間出現第一次明顯的質量損失,損失約為15%,說明天然除蟲菊酯原藥開始分解;第二個較為急速的質量損失出現在250℃~350℃范圍內,損失量約為50%,說明天然除蟲菊酯的熱解主要集中在此溫度范圍內;最后在350℃~480℃范圍內,曲線1出現了第三階段天然除蟲菊酯的質量損失,此時熱解完全,原藥幾乎無剩余.

而從圖線2和3中可看出,130℃~200℃之間微膠囊?guī)缀鯚o質量損失,這是由于β-環(huán)糊精在此溫度范圍內熱穩(wěn)定性顯著,保護了內部的天然除蟲菊酯活性成分,阻止或減緩其損失.在280℃時除蟲菊酯微膠囊存在明顯的質量損失,且相對圖線2,其分解溫度減小,曲線前移,說明除蟲菊酯的存在使β-環(huán)糊精結構發(fā)生了微小變化.這一結果也與Prabu等[18]對咖啡因包合物與β-環(huán)糊精包合物及其各自的純化合物的分解溫度的研究結果相似.也有研究表明[19],主、客體間的疏水相互作用在包合物的熱穩(wěn)定性方面起重要的作用.同時,曲線3相對于曲線1后移,熱分解溫度向高溫度移動.說明微膠囊相對于原藥可以耐受更高的溫度而不發(fā)生較大的質量損失.以上說明,以β-環(huán)糊精為壁材制備的除蟲菊酯微膠囊相比于天然除蟲菊酯具有更好的熱穩(wěn)定性.

a TG曲線

b DTG曲線

2.5 緩釋性能分析

圖7為天然除蟲菊酯原藥和以β-環(huán)糊精為壁材的微膠囊的緩釋曲線.從圖中可以看出,天然除蟲菊酯原藥在20 h累計釋放率達到85%,并在此之后累計釋放率增速極其緩慢,在34 h,累計釋放率達到99.6%,釋放將近完全.而以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊在20 h的累計釋放率為55%,在34 h累計釋放率達到71.5%,此后累計釋放率增速減緩,直至70 h,累計釋放率達到89.3%.

為了進一步考察微膠囊的釋放動力學,將微膠囊的緩釋數據分別代入常見的4種釋放動力學模型進行參數擬合:零級動力學模型、一級動力學模型、Higuchi模型、Ritger-peppas模型,4種釋放動力學模型的擬合公式及其對應相關系數R2見表1.表中t為時間,h;Q為t時所對應的累計釋放率.

圖7 微膠囊的緩釋曲線

表1 動力學模型擬合結果

對4種不同動力學模型的擬合結果比較可知,以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊的緩釋機制最符合一級動力學模型,其擴散行為與時間t存在指數相關關系.該模型擬合下微膠囊釋放方程為Q= 88.05 ( 1-e-0.055 t),相關系數R2=0.995 5.而閆丹丹[20]制備的丁香精油/β-環(huán)糊精微膠囊緩釋結果也接近一級擬合模型,結果相似.微膠囊累計釋放率的一級動力學模型擬合曲線如圖8所示.

圖8 微膠囊累計釋放率的一級動力學模型擬合曲線

從圖8中可以看出,微膠囊芯材的釋放行為可以分為兩個階段,在2~30 h時,微膠囊內外濃度差較大,囊內活性成分釋放速率較快,30 h后,隨著微膠囊囊內活性成分的減少,擴散驅動力減小,釋放速率減緩,最終緩慢釋放完全.

以上說明,以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊具有良好的緩釋性能,且相對原藥緩慢釋放效果更佳,持效性長,其緩釋行為符合一級動力學模型.

2.6 儲存穩(wěn)定性分析

圖9是在4℃冰箱中保存一段時間后,微膠囊的掃描電鏡圖.圖9a、9b和9c分別是儲存0、5、9個月后的SEM圖,對比圖9a、9b可見微膠囊表面沒有發(fā)生太大的變化;圖c中的微膠囊表面有破裂現象,此為儲存時間太長導致壁材的機械性能變差,從而發(fā)生破裂.

通過測定不同儲存時間下微膠囊的載藥率,可計算出芯材隨著儲存時間的殘留率.如圖10可見5個月后,微膠囊的殘留載藥率為87.2%,9個月后芯材損失了約50%.可見以β-環(huán)糊精為壁材的微膠囊具有較好的儲存穩(wěn)定,而為了更好地提高微膠囊的作用效果和持效性,建議儲存時間為5個月內的微膠囊可以繼續(xù)使用,而更長儲存時間的微膠囊在使用過程中需要提高劑量以達到同樣的殺蟲效果.

2.7 作用時長分析

圖11是將含有相同除蟲菊酯濃度的微膠囊懸浮劑和原藥水乳劑放置于自然條件下,進而模擬在使用過程中兩者作用時長的對比圖.從圖中可看出,

a 0個月

b 5個月

c 9個月

在使用過程中,原藥水乳劑的殘留率在6 d后即下降為12%,而10 d后完全分解;微膠囊懸浮劑在6 d后載藥殘留率為40%,在15 d時仍有15%的載藥率.邵凡旭等[21]研究發(fā)現25%除蟲菊素69 g·ha-1(6.9×10-3g·m-2)對棕櫚薊馬藥后3 d的防效接近或超過60%,但持效期較短,藥后7 d防效大幅下降;而5%除蟲菊素乳油800,1000倍液噴霧防治孔雀竹芋紅蜘蛛和桃樹紅蜘蛛的持效期也在7 d左右[22-23].

從作用時長對比圖分析可知,微膠囊相比原藥制劑可以延長1~1.5倍的作用時間,降低了使用頻率,可達到減少約45%使用成本的效果,具有實際應用價值.

2.8 殺蟲活性分析

以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊對淡色庫蚊和白紋伊蚊幼蟲的生物毒性測定結果如表2所示,其中LC50為殺死50%防治對象的藥劑質量濃度,LC90為殺死90%防治對象的藥劑質量濃度,mg·L-1.從表中可看出,所制微膠囊對于蚊子具有很好的防治效果.

圖10 微膠囊的儲存穩(wěn)定性

圖11 作用時長對比圖

表2 淡色庫蚊幼蟲和白紋伊蚊幼蟲的毒性測定結果

采用生物統(tǒng)計軟件計算出微膠囊對二化螟、蚜蟲和粘蟲的LC50等統(tǒng)計數據,得出結果如表3所示,其中括號內數字表示致死濃度的波動范圍.此三種害蟲的LC50、LC90基本上小于50 mg·L-1,可見微膠囊對此三種害蟲具有較高的殺蟲活性,可以在防治二化螟、蠶豆蚜和粘蟲時單獨使用,由于其作用快速,適宜在卵孵高峰期施藥,等幼蟲開始危害時正好發(fā)揮藥效.

3 結論

本研究采用包合法制備了以β-環(huán)糊精為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊,包埋率為92.15%,載藥率為8.5%,粒徑范圍為1~17 μm.熱重法分析表明微膠囊阻止或減緩了天然除蟲菊酯在130℃時的第一階段的熱分解,且出現急速質量損失的熱分解溫度向更高方向移動,相對于原藥可以耐受更高的溫度,具有較好的熱穩(wěn)定性.透析袋緩釋實驗表明天然除蟲菊酯微膠囊相對原藥緩慢釋放效果更佳,持效性長,具有良好的緩釋性能且其緩釋行為符合一級動力學模型.在4℃冰箱內避光保存5個月后,微膠囊的形態(tài)仍然完整,載藥率降低了約13%,說明微膠囊具有良好的儲存穩(wěn)定性.自然條件下,微膠囊相比原藥制劑可以延長1~1.5倍的作用時間,降低了使用頻率,可以減少約45%的使用成本,具有實際應用價值.

表3 施藥24 h后三種害蟲的毒力基線統(tǒng)計

微膠囊對淡色庫蚊幼蟲和白紋伊蚊幼蟲的LC50分別為0.77×10-6和1.81×10-6mg·L-1,LC90分別為2.63×10-6和3.73×10-6mg·L-1,在滅蚊方面表現出較高的活性.采用生物統(tǒng)計軟件計算出二化螟、蚜蟲和粘蟲的LC50、LC90基本上小于50 mg·L-1,可見微膠囊對此三種害蟲具有較高的殺蟲活性,可以在防治二化螟、蠶豆蚜和粘蟲時單獨使用,由于其作用快速,適宜在卵孵高峰期施藥,等幼蟲開始危害時正好發(fā)揮藥效.