王佳娜 薛 傲 張 悅 王 巖 姚 遠(yuǎn) 張 寧 劉 斌

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040

2 型糖尿?。═2DM）是一種常見的內(nèi)分泌類代謝性病癥，主要臨床特征為慢性高血糖、胰島素分泌不足等，其通常表現(xiàn)為整體性的代謝紊亂[1-2]。繼發(fā)于糖尿病的心血管疾病是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[3]，現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為T2DM 是多種危險因素共同作用形成的。代謝組學(xué)[4-6]是通過對生物體內(nèi)所有的代謝物進(jìn)行定量分析，來尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系一門學(xué)科。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[7-10]是目前研究中最常用的一種代謝組學(xué)研究技術(shù)，是集色譜法的高分離能力和質(zhì)譜法的結(jié)構(gòu)鑒定準(zhǔn)確能力于一體的分析方法，可檢測大量小分子代謝物，并具有受機(jī)體效應(yīng)影響小的特點(diǎn)，為代謝組學(xué)在復(fù)雜化合物研究提供了一種高效的定性和定量工具。

1 對象與方法

1.1 儀器

6890N-5975B 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；KQ5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；TGL-16G-C 高速臺式冷凍離心機(jī)（離心機(jī)半徑5.9 cm，上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZF-6020 真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；Thermo Scientific Forma 702 超低溫冰箱（Thermo）；HGC-12A 氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑

乙腈（Honeywell Burdick &Jackson，DF658）；吡啶（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20120206）；甲氧胺鹽酸鹽（LR10O40）、N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺（MSTFA，LS70O107）購于北京百靈威科技有限公司；三甲基一氯硅烷（TMCS，ACROS ORGANICS，A0330141）；二十二烷（東京化工業(yè)株式會社，F(xiàn)14S034）；氦氣純度為99.999%（哈爾濱卿華工業(yè)氣體有限公司）。

1.3 樣品

實(shí)驗(yàn)中所使用的人體血漿樣本均取得本人同意后，清晨（即空腹8 h 以上）采集肘部靜脈血，樣本均由黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院腎內(nèi)科于2018 年6—7 月收集，健康組（60 名）為正常人血漿樣本，T2DM組（100 例）為T2DM 患者血漿樣本。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

二十二烷正庚烷溶液（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)液）：取0.005 g 二十二烷，置入50 mL 容量瓶中，用正庚烷定容至刻度，搖勻，備用；甲氧胺吡啶溶液：稱取0.15 g 甲氧胺鹽酸鹽，置入10 mL 容量瓶中，用吡啶溶液定容至刻度，搖勻，備用；硅烷化衍生化試劑：分別取MSTFA 溶液10 mL，TMCS 溶液100 μL 混合均勻，備用。

樣品在4℃冰水上解凍30～60 min，取100 μL 樣品至離心管中，加入400 μL 萃取溶劑渦旋混合15 s，-20℃下放置10 min，在4℃、10 000 r/min 離心10 min，取400 μL 上清液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管內(nèi)，氮吹后，將其加入100 μL 甲氧胺吡啶溶液，加入100 μL 衍生化試劑，并加入100 μL 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)液，常溫3000 r/min 離心10 min，取上清液至離心管中，待GC-MS 分析。

2.2 GC-MS 條件

色譜柱DB-5MS 柱；進(jìn)樣口溫度270℃；分流比10∶1；流速：1.0 mL/min；載氣：He（99.999%）；進(jìn)樣量1 μL；溶劑延遲3 min。采用正離子模式，四級桿溫度為150℃；電離方式：EI；離子源溫度：230℃；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍m/z 30～600；掃描間隔0.2 s；電子倍增電壓0.9 kV。升溫 程序：0～3 min，90～220℃；3～32.5 min，220～280℃；后運(yùn)行溫度280℃；后運(yùn)行時間5 min。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 精密度

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，色譜峰個數(shù)和主要共有峰相對面積的RSD 均小于5%，提示儀器精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性

取樣品平行制備6 份供試品溶液，比較色譜峰個數(shù)及主要共有色譜峰的相對峰面積，得RSD 值均小于5%，提示供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性

2.6.1 日內(nèi)穩(wěn)定性 樣品按“2.1”項下方法處理后放置于4℃冰箱內(nèi)，在0、2、4、6、8、10 h 分別進(jìn)樣，比較6 次進(jìn)樣后色譜峰的個數(shù)和主要共有峰的相對峰面積，得RSD 值均小于5%，提示供試品穩(wěn)定性良好。

2.6.2 凍融穩(wěn)定性 -80℃冷凍樣品融化后，取400 μL至離心管后，立即將樣品放回-80℃冰箱中，至完全冷凍后再取出，融化，取100 μL 至離心管中，按上述方法重復(fù)4 次后，制備所有取出樣品，按“2.1”項下方法制備，分別比較樣品峰的個數(shù)和共有峰相對峰面積，得RSD 值均小于5%，說明樣品具有很好的穩(wěn)定性。

2.7 血漿樣品代謝譜建立

按“2.1”項下分析得到健康組和T2DM 組的血漿樣品GC-MS 圖，見圖1。由于實(shí)驗(yàn)樣本較多，為減少實(shí)驗(yàn)樣本批次之間保留時間的漂移、色譜圖背景不一致等影響，采用自動質(zhì)譜去卷積鑒定系統(tǒng)、NIST05a質(zhì)譜庫、MZ-mine 等進(jìn)行分析。共鑒定化合物37 種。

2.8 血漿樣品代謝譜主成分分析（PCA）

T2DM 組和健康組血漿樣品代謝譜的PCA 圖，見圖2。PCA 圖直觀反映了兩組間存在代謝模式的差異。

圖1 血漿樣品GC-MS 總離子流圖

2.9 血漿樣品偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）模型

通過PCA 分析結(jié)果可以看出，兩組的血漿樣品存在顯著差異，為進(jìn)一步區(qū)分這兩類群體，建立了具有更準(zhǔn)確預(yù)測能力的PLS-DA 判別模型。見圖3。

2.10 潛在生物標(biāo)志物的確定

圖2 血漿樣品代謝譜的PCA 圖

圖3 血漿代謝譜的PLS-DA 圖

通過對圖3 的觀察，可知健康組和T2DM 組的代謝圖譜類似，只是在含量上有所不同。因此，引用SIMCAP 11.5 對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，采用PLS-DA 載荷矩陣圖（見圖4）對兩組進(jìn)行識別結(jié)合血漿供試品VIP圖結(jié)合S 圖（見圖5），選取對分類貢獻(xiàn)較大的變量。通過以上分析篩選，最終得到血漿樣品的10 個差異代謝物（見表1），并對健康組和T2DM 組間進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析（見表2），得到P <0.05 的潛在生物標(biāo)志物確定為內(nèi)源性生物標(biāo)志物。

圖4 血漿供試品PLS-DA 圖

圖5 血漿供試品VIP 圖結(jié)合S 圖

表1 生物標(biāo)志物信息表

3 討論

萃取溶劑主要對乙腈、甲醇用于樣品代謝譜的影響做對比研究。結(jié)果顯示色譜峰濾噪前乙腈處理的色譜峰個數(shù)及峰面積均低于甲醇，濾噪后結(jié)果相差不大。綜上，本實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為萃取劑。

對樣品肟化條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)70℃反應(yīng)1 h 所得的代謝物峰的個數(shù)及峰面積優(yōu)于70℃反應(yīng)0.5 h，而37℃反應(yīng)12 h 與70℃反應(yīng)1 h 結(jié)果相差不大。綜上，肟化條件為70℃反應(yīng)1 h。

衍生化條件發(fā)現(xiàn)，60℃反應(yīng)1 h 的峰面積部分低于60℃反應(yīng)2 h 和37℃反應(yīng)12 h，37℃反應(yīng)12 h 部分峰面積高于60℃反應(yīng)2 h，可能是由于37℃反應(yīng)12 h時間過久致部分樣品揮發(fā)濃度增高，綜上衍生化條件為60℃反應(yīng)2 h。

本研究建立了基于GC-MS 的T2DM 血漿代謝組學(xué)分析方法[11-12]，其中包括供試品溶液的制備方法，血漿代謝圖譜的建立和內(nèi)源性代謝物的鑒定。通過衍生化方法最大限度的采集到代謝信息。通過多元統(tǒng)計分析方法并結(jié)合NIST05a 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，對血漿中的代謝物進(jìn)行了定性、定量分析，成功鑒定出血漿內(nèi)源性代謝物。其中L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、檸檬酸、酪氨酸呈下降趨勢；乳酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸呈上升趨勢。經(jīng)過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，這些代謝產(chǎn)物主要與氨基酸代謝、糖脂代謝和能量代謝等途徑相關(guān)[13-15]。文獻(xiàn)顯示[16-20]，T2DM 患者的糖脂代謝、氨基酸代謝等多種代謝途徑均發(fā)生了不同程度的紊亂。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)T2DM 研究提供基礎(chǔ)。

表2 兩組血漿樣品標(biāo)志物水平比較