李 晰 吳 丹 趙 美 肖愛萍 孫 濤 趙敏杰 劉琳娜 張 琰

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710038

腸康膠囊[蘭制字（2011）F68014 號]為空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）根據(jù)驗方研制并采用現(xiàn)代制劑技術(shù)制備的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，組方依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)古方，由黃連、木香、血竭、延胡索等藥味組成，具有益氣固本，健脾滲濕，固腸止瀉的功效，適應(yīng)于結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎及各種急慢性腸炎。為了有效控制腸康膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床治療效果，本研究建立了薄層層析法（TLC）用于定性鑒別腸康膠囊中的黃連、木香、血竭、延胡索；并建立了高效液相色譜法（HPLC）用于同時測定黃連中的主要有效成分小檗堿及巴馬汀的含量。經(jīng)過方法學(xué)驗證，本研究確立的定性定量分析方法能夠客觀的反映腸康膠囊的內(nèi)在品質(zhì)，為本品的質(zhì)量控制與評價指標(biāo)提供重要的理論依據(jù)，為提高藥品的安全性及有效性奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZF-2C 型暗箱式自動UV 分析儀（上海安靈電子儀器廠）；安捷倫1260 型HPLC 分析儀（美國安捷倫科技公司）；BP211D 型電子天平（萬分之一，德國賽多利斯集團）；KH5200DB 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；硅膠G 預(yù)制薄層板（青島海洋化工有限公司、青島海浪硅膠有限公司、浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.2 試藥

黃連藥材對照品（批號：120921～201309）、木香藥材對照品（批號：120921～201309）、延胡索藥材對照品（批號：120928～201208）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713～201212，純度：86.7%）、鹽酸巴馬汀對照品（批號：110732～201309，純度：87.4%）、延胡索乙素對照品（批號：110726～201516，純度：99.8%），上述對照品均購于中國藥品生物制品檢定所；腸康膠囊[由我院提供，蘭制字（2011）F68014 號，規(guī)格：每粒0.45 g，批號：20130904、20121204、20131104]；所用藥材均購于西安藻露堂西京醫(yī)藥有限公司；乙腈（賽默飛世爾科技公司）和冰乙酸（迪馬科技有限公司）為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃連的薄層鑒別 取本品2 粒，內(nèi)容物傾出置于干燥的錐形瓶中，加甲醇10 mL，振搖提取5 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取黃連藥材對照品0.1 g，按上述方法制成黃連對照藥材溶液。另用天平稱取鹽酸小檗堿對照品，定量甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的溶液，作為鹽酸小檗堿對照品溶液。不含黃連的陰性樣品根據(jù)處方比例及制備工藝制成，并以供試品溶液制備方法制成相應(yīng)陰性對照溶液。分別吸取上述4 種溶液各1 μL，依次點于薄層板上，以異丙醇-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水（1.5∶3.0∶6.0∶1.5∶0.3）為展開劑，以40%的濃氨水溶液將展開系統(tǒng)飽和15 min后展開薄層板，展距8 cm，取出晾干，于紫外光燈（365 nm）下檢視。在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液色譜所顯同一顏色熒光斑點，陰性對照溶液在對應(yīng)位置處，無其他成分斑點干擾（圖1）。

圖1 黃連薄層色譜圖

2.1.2 木香的薄層鑒別 取本品10 粒，將內(nèi)容物傾出置于干燥錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液于60℃水浴鍋中揮干溶劑，殘渣加甲醇1 mL復(fù)溶，作為供試品溶液。另取木香藥材對照品0.5 g，按上述方法制成木香對照藥材溶液。不含木香的陰性樣品根據(jù)處方比例及制備工藝制成，并以試品溶液制備方法制成相應(yīng)陰性對照溶液。分別吸取上述3 種溶液各1 μL，依次點于薄層板上，以甲酸乙酯-環(huán)己烷-甲酸（1.0∶3.0∶0.2）混合溶液為展開劑，將薄層板放置于展開系統(tǒng)中，飽和20 min 后展開，展距8 cm，取出晾干，香草醛硫酸溶液為顯色劑噴于薄層板表面，吹風(fēng)機加熱使斑點顯色清晰。在與木香對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液色譜所顯同一顏色熒光斑點，陰性對照溶液在對應(yīng)位置處無其他成分斑點干擾（圖2）。

圖2 木香薄層色譜圖

2.1.3 血竭的薄層鑒別 取本品2 粒，內(nèi)容物傾出置于干燥錐形瓶中，加乙酸乙酯10 mL 振搖提取5 min，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取血竭0.1 g，按上述方法制成血竭對照藥材溶液。另取血竭素高氯酸鹽對照品約9 mg，置于50 mL 棕色量瓶中，加入含3%H3PO4的甲醇溶液使溶解，并定容至刻度，充分搖勻，精密量取1 mL，置5mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作為血竭素高氯酸鹽對照品溶液。不含血竭的陰性樣品根據(jù)腸康膠囊的處方比例及制備工藝制成，并以試品溶液制備方法制成相應(yīng)陰性對照溶液。分別吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液5 μL，以及血竭素高氯酸鹽對照品溶液、血竭對照藥材溶液各3 μL，依次點于薄層板上，以甲醇-二氯甲烷（1∶19）混合溶液為展開劑，將薄層板置于展開系統(tǒng)中，飽和20 min 后展開，展距8 cm，取出晾干，日光下檢視。在與血竭素高氯酸鹽對照品溶液和血竭對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液色譜所顯同一顏色熒光斑點，陰性對照溶液在對應(yīng)位置處無其他成分斑點干擾（圖3）。

圖3 血竭薄層色譜圖

2.1.4 延胡索的薄層鑒別 取本品內(nèi)容物20 g，置于干燥的錐形瓶中，加甲醇100 mL，超聲處理30 min，濾過，80℃水浴蒸干溶劑，殘渣加30 mL 水復(fù)溶，并滴加氨試液將溶液調(diào)至堿性，乙酸乙酯每次30 mL 萃取3 次，合并乙酸乙酯層溶液，并于80℃水浴揮干乙酸乙酯溶劑，所得殘渣加1 mL 甲醇復(fù)溶，作為供試品溶液。另取延胡索藥材對照品1 g，按上述方法制成延胡索對照藥材溶液。另稱取延胡索乙素對照品，定量甲醇制成0.5 mg/mL 的延胡索乙素對照品溶液。不含延胡索的陰性樣品根據(jù)處方比例及制備工藝制成，并以試品溶液制備方法制成相應(yīng)陰性對照溶液。分別吸取上述供試品溶液、不含延胡索的陰性對照溶液各3 μL，延胡索乙素對照品溶液、延胡索對照藥材溶液各1 μL，依次點于薄層板上，以丙酮-甲苯（1.0∶4.5）混合溶液為展開劑，將薄層板置于展開系統(tǒng)中飽和20 min 后展開，展距8 cm，取出晾干，置碘缸中約3 min 后取出，室溫下?lián)]盡薄層板上吸附的碘后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在與延胡索對照藥材和延胡索乙素對照品色譜相應(yīng)的位置處，供試品溶液色譜所顯同一顏色熒光斑點，陰性對照溶液在對應(yīng)位置處無其他成分斑點干擾（圖4）。

圖4 延胡索薄層色譜圖

2.1.5 薄層鑒別方法學(xué)驗證 薄層鑒別方法均根據(jù)《中華人民共和國藥典2015 年版》[1]四部通則TLC 法試驗標(biāo)準(zhǔn)操作，并進行了溶液穩(wěn)定性、樣品提取時間、樣品萃取次數(shù)以及不同品牌薄層板、溫度、相對濕度對薄層展開的影響。

方法學(xué)驗證結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定性良好；不同品牌薄層板測定斑點清晰，且背景無干擾；濕度32%～88%條件下均可得到清晰斑點，且背景無干擾；木香主斑點在4℃、25℃條件下的比移值有增大，斑點清晰，背景無干擾，不影響鑒別結(jié)果，但在32℃條件下的比移值明顯增大，且斑點易偏斜，其他供試品主斑點在4～32℃條件下的比移值隨溫度升高而稍有增大，但斑點清晰，背景無干擾，不影響鑒別結(jié)果；并根據(jù)薄層色譜斑點確定了黃連、木香、血竭、延胡索提取時間及延胡索提取液經(jīng)乙酸乙酯萃取次數(shù)。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取適量的鹽酸小檗堿對照品，甲醇溶解，充分搖勻后定容，制得質(zhì)量濃度為98.0 μg/mL 的鹽酸小檗堿對照品貯備液。精密稱取適量的鹽酸巴馬汀對照品，加甲醇溶解，充分搖勻后定容，制得質(zhì)量濃度為31.8 μg/mL 的鹽酸巴馬汀對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，加入鹽酸-甲醇（1∶100）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，置于室溫下放涼，再次稱定重量，以甲醇補足超聲過程中損失的重量，充分搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 缺黃連陰性對照溶液的制備 不含黃連的陰性樣品根據(jù)處方比例及制備工藝制成，并根據(jù)“2.2.2”項制成缺黃連陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 Angilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱；流動相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液（50∶50，v/v）（每100 mL 溶液中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以H3PO4調(diào)pH 值至4.0）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按小檗堿色譜峰及按巴馬汀色譜峰計算不低于2000。目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度良好，陰性對照溶液無雜質(zhì)干擾（圖5）。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取儲備液溶液適量，用甲醇稀釋成含鹽酸小檗堿（29.4、58.8、68.6、78.4、98.0 μg/mL）系列對照品溶液及含鹽酸巴馬汀（7.1、14.2、17.8、25.4、31.8 μg/mL）系列對照品溶液，測定小檗堿及巴馬汀色譜峰面積，并分別以濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），計算線性回歸方程。小檗堿在線性范圍29.4～98.0 μg/mL、巴馬汀在線性范圍7.1～31.8 μg/mL 內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。見表1。

圖5 HPLC 色譜圖

表1 小檗堿、巴馬汀線性關(guān)系

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一濃度的供試品溶液，重復(fù)進樣6 次，HPLC 測定小檗堿色譜峰及巴馬汀色譜峰面積，結(jié)果顯示小檗堿峰面積的RSD 為0.22%（n=6），巴馬汀峰面積的RSD 為0.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同生產(chǎn)批號內(nèi)容物6 份各0.5 g，依照“2.2.2”項方法制備并進行HPLC 測定小檗堿、巴馬汀的峰面積。測得重復(fù)性試驗樣品中小檗堿的峰面積RSD 為1.65%（n=6），巴馬汀的峰面積RSD為1.28%（n=6），表明該分析方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.7”項下供試品溶液，分別在供試品溶液制備后4 個時間點：0、6、12、24 h 進行HPLC 測定小檗堿、巴馬汀的峰面積，結(jié)果顯示不同時間點時小檗堿的色譜峰面積RSD 值為0.75%，巴馬汀的色譜峰面積RSD 值為0.76%，表明供試品溶液在制備后的24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 取同生產(chǎn)批號已知含量的腸康膠囊內(nèi)容物9 份各0.5 g，精密稱定，分3 組，每組3 份，分別加入高、中、低3 種濃度的鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀對照品溶液，依照“2.2.2”項方法制備，測定小檗堿、巴馬汀的峰面積，計算腸康膠囊中小檗堿、巴馬汀的平均加樣回收率及RSD 值，結(jié)果顯示該測定方法加樣回收率良好。見表2～3。

表2 小檗堿加樣回收率

表3 巴馬汀加樣回收率

2.2.10 樣品含量測定 取不同生產(chǎn)批號腸康膠囊樣品（20130904、20121204、20131104），按“2.2.2”項下制備并進行含量測定。見表4。

表4 腸康膠囊樣品的含量測定結(jié)果（mg/粒）

3 討論

3.1 黃連的含量測定

黃連為腸康膠囊制劑中的君藥，其主要藥效成分為小檗堿、巴馬汀等生物堿?！吨腥A人民共和國藥典2015 年版》[2]中黃連藥材的含量測定采用HPLC，以鹽酸小檗堿計小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿四種生物堿的含量。巴馬汀為季銨型生物堿，近年來藥理學(xué)研究表明具有較好的清熱解毒功效，臨床上主要用于治療婦科炎癥、腸道炎癥、呼吸道以及泌尿道感染等疾病[3-5]。故本研究在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對小檗堿進行含量測定的基礎(chǔ)上，增加另一藥效成分巴馬汀的含量測定[6-8]，更好地控制制劑的內(nèi)在品質(zhì)，保證藥物的臨床治療效果。

3.2 黃連、木香的鑒別方法優(yōu)化

黃連中有效成分主要為生物堿，在甲醇中溶解度較高[9-10]，經(jīng)提取方法、提取時間考察發(fā)現(xiàn)，振搖5 min即可將黃連中有效成分提取以供鑒別，可極大程度縮短檢驗操作時間，更便于實驗操作。

木香主要有效成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，在有效成分提取時常采用醇提法[11-12]，且揮發(fā)油類物質(zhì)熱穩(wěn)定性較差[13-14]，因此將提取方法改為甲醇超聲提取后60℃水浴鍋揮干復(fù)溶，經(jīng)方法學(xué)驗證表明，該提取方法可有效提取木香中的主要成分。

3.3 血竭、延胡索的鑒別方法考察

血竭素為血竭中的主要有效成分，具有較強的鎮(zhèn)痛、止血作用[15-16]，胡索中的延胡索乙素具有抗?jié)兊乃幚碜饔?，臨床常配伍其他中藥治療多種消化系統(tǒng)疾病[17-19]。故本研究在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了血竭、延胡索兩味藥材的TLC 鑒別方法。

血竭、延胡索的TLC 鑒別方法均參照《中華人民共和國藥典2015 年版》[1]血竭藥材、延胡索藥材的TLC鑒別方法，但原方法中使用易制毒試劑“乙醚”“氯仿”作為提取溶劑和展開溶劑，影響檢驗操作的安全性，因此對原TLC 鑒別方法進行溶劑的優(yōu)化改進，采用“乙酸乙酯”代替“乙醚”，“二氯甲烷”代替“氯仿”[20-21]，有效提高了檢驗操作的安全性，并為尋找易制毒試劑的替代溶劑提供了實驗依據(jù)。