姜燕平 荀延萍 傅佳儀 張仕蓉 趙妍妍 馬勝林

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，浙江杭州 310006；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310006

結(jié)直腸癌是全球第二大常見癌癥[1]。與發(fā)達(dá)國家比較，中國患者病死率與死亡率較高[2-3]。改善結(jié)直腸癌患者治療效果的基石之一是找到腫瘤相關(guān)的基因突變[4]。絲/蘇氨酸特異性激酶（BRAF）在絲裂原活化蛋白激酶途徑的激活中起重要作用，有助于細(xì)胞生長，增殖和分化。BRAF V600E 突變是其主要突變類型，可以調(diào)節(jié)磷酸化使BRAF 活性提高近10 倍[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，患有BRAF V600E 突變的結(jié)直腸癌患者的中位生存期比未突變的結(jié)直腸癌患者短10～16 個月。因此，選擇適當(dāng)?shù)腂RAF 基因突變的檢測方法對結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后有重要意義。擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（ARMS）被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)、簡便的檢測方法，在臨床實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用[7-8]。近年來，數(shù)字油滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（ddPCR）發(fā)展迅速，且與ARMS 法比較，是一種不依賴于CT 值且不受擴(kuò)增效率影響的絕對定量技術(shù)[9]。本研究采用ddPCR 法和ARMS 法分析比較結(jié)直腸癌患者BRAF 基因突變的檢測結(jié)果，以期為結(jié)直腸癌的診斷治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年4 月—2019 年7 月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院杭州市第一人民醫(yī)院診治的結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本162 例（倫理號：2018-15-02）。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受手術(shù)治療，且病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受放化療或免疫治療；②合并其他惡性腫瘤；③術(shù)前有明確的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)后3 個月內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④骨髓功能異常或凝血功能異常；⑤嚴(yán)重的心、腦、肝和腎功能障礙；⑥資料不完整。患者年齡18～95 歲，平均（52.31±12.36）歲；男101 例，女61 例；發(fā)病部位：直腸62 例，乙狀結(jié)腸46 例，橫結(jié)腸29 例，升結(jié)腸16 例，盲腸9 例；乳頭狀腺癌82 例，高分化腺癌62 例，低分化腺癌18 例；隆起型75 例，浸潤型62 例，潰瘍型25 例；Ⅰ～Ⅱ期93 例，Ⅲ～Ⅳ期69 例。

1.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

分析ARMS 法和ddPCR 法結(jié)直腸癌患者BRAF V600E 突變檢測陽性率及一致性；分析BRAF V600E突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

ARMS 法：穿刺樣本的石蠟包埋組織切片要求≥3 mm 厚度，腫瘤細(xì)胞數(shù)≥200 個。取3 塊石蠟切片，使用QIAampDNAFFPETissueKit 試劑盒（德國QIAGEN 公司，貨號：56404）提取DNA。采用BRAF 基因突變檢測試劑盒（北京雅康博生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20171203） 結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR 儀（Life Technologies Holdings Pte Ltd.，7500） 檢 測BRAF V600E 的突變情況。具體步驟：將提取的核酸稀釋至10 ng/mL，取20 mL 用于試驗(yàn)產(chǎn)品檢測，反應(yīng)程序：95℃10 min、95℃15 s、60 s 循環(huán)40 次。采集各樣本的Ct，突變位點(diǎn)存在擴(kuò)增，且Ct 值≤35，該樣本突變型；Ct 值＞38 或無擴(kuò)增，該樣本為野生型。

ddPCR 法：采用上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司提供的人BRAF 基因突變檢測試劑盒（生產(chǎn)批號：20180125）結(jié)合ddPCR 微滴閥讀儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，QX-200）進(jìn)行檢測。具體步驟：石蠟切片進(jìn)行組織DNA 的提取同ARMS，取6 mL，2000 r/min離心10 s，加至PCR 預(yù)混液的PCR 管，反應(yīng)體系總體積20 mL，進(jìn)樣ddPCR 微滴閥讀儀，樣本落在“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)且突變比例為1%，該樣本突變型，否則為野生型。

高通量測序分析：當(dāng)ARMS 法與ddPCR 法存在歧義時，采用高通量測序，對PCR 產(chǎn)物在質(zhì)控后純化，在MiSeq 基因測序儀（美國Illumina 公司）進(jìn)行測序，以高通量測序數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。通過χ2檢驗(yàn)評價ARMS 法和ddPCR 法在評估結(jié)直腸癌的BRAF 基因突變的一致性及人BRAF V600E 突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。采用正態(tài)近似法計(jì)算一致性的置信區(qū)間。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAF V600E 突變檢測結(jié)果

在162 例結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中，ARMS 法檢測BRAF V600E 突變陽性率為8.64%（14/162），ddPCR法檢測BRAF V600E 突變陽性率為9.26%（15/162）。對ARMS 法檢測BRAF V600E 突變存在歧義的1 例進(jìn)行高通量測序，ddPCR 法與高通量測序的結(jié)果一致。對應(yīng)ddPCR 法，ARMS 法的敏感性為100%（14/14）、特異性為99.32%（147/148）、準(zhǔn)確性為99.38%（161/162）、假陰性率為6.67%（1/15）、陽性符合率為93.33%（14/15）和陰性符合率為99.32%（147/148）。ARMS 法和ddPCR 法檢測一致性為99.38%（161/162，95%CI：0.963～0.999）。見表1、圖1～2。

表1 BRAF V600E 突變檢測結(jié)果（n）

圖1 人BRAF V600E 突變

圖2 高通量測序人BRAF V600E 突變

2.2 人BRAF V600E 突變與臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、部位、病理分型結(jié)直腸癌患者BRAF V600E突變分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。年齡越高、組織學(xué)類型低分化、Ⅲ～Ⅳ期患者BRAF V600E 突變分布越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

3 討論

ARMS 檢測基因突變的基本原理在于，PCR 擴(kuò)增引物是否延續(xù)與引物3′端的堿基與模板配對有關(guān)，不能配對則不能延伸，因此設(shè)計(jì)合適的引物即可用于區(qū)分突變與正常的DNA 序列。在本研究中，PCR 擴(kuò)增時只擴(kuò)增BRAF，無突變序列不擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物未含未突變的等位基因片段，靈敏度較高，如張瑩等[10]采用ARMS 法從60 例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除組織中檢出3 例BRAF V600E 突變。但報(bào)道也顯示，ARMS 存在假陰性。如本研究結(jié)果顯示，ARMS 檢測BRAF V600E突變存在1 例假陰性，因此需要通過加大DNA 模版量、更換試劑盒、更換操作人員等克服假陰性的缺陷。

Kary 等于1985 年創(chuàng)立了PCR 來對核酸進(jìn)行定量分析[11]。盡管此方法具有很高的靈敏度，但許多不準(zhǔn)確的因素可能會影響對轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的評估[12]。新一代的實(shí)時熒光定量PCR（qPCR），可以通過將qPCR 的熒光輸出曲線與不同的已知初始DNA 拷貝數(shù)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較從而確定DNA 模板的初始含量[13]。相較于普通PCR，qPCR 的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確[14]。Vogelstein 等[15]于1999 年發(fā)展了ddPCR，在結(jié)直腸癌患者中成功檢測出具有高度敏感性的Ras 突變。ddPCR 的關(guān)鍵是將PCR 混合物與必要的熒光團(tuán)分為數(shù)千個單獨(dú)的PCR 反應(yīng)單元，每個單元都經(jīng)歷與常規(guī)PCR 相同的熱循環(huán)[16-17]。與qPCR 比較，ddPCR 不依賴于CT 值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來計(jì)算每個反應(yīng)單元的平均濃度，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，具有高精度、高準(zhǔn)確性，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量以及出色的重現(xiàn)性和一致性的優(yōu)點(diǎn)[18]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，ddPCR 對不同類型的抑制劑比qPCR 可能具有更高的耐受性，可防止核酸提取過程中帶入的雜質(zhì)（如離子去污劑、乙醇、異丙醇等）檢測結(jié)果的影響[19-20]。

表2 人BRAF V600E 突變與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

本研究發(fā)現(xiàn)ddPCR 法與高通量測序結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)ddPCR 的高精度和高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。Xu等[21]研究顯示ddPCR 具有較高的重復(fù)性和靈敏性，160 例乳頭狀甲狀腺癌患者中檢出128 例BRAF V600E突變，其中4 例BRAF V600E 突變陽性患者ARMS檢出為陰性。毛旭華等[22]研究顯示，與ARMS 法比較，ddPCR 可檢出更多的EGFR T790 突變。曹紫陽等[23]從ARMS 法檢測的10 例EGFR T790 突變陰性病例中，以ddPCR 檢出陽性3 例。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)年齡越高、組織學(xué)類型低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者BRAF V600E 突變分布較高，與報(bào)道結(jié)果類似[5,24-26]?？梢奦600E 突變的BRAF 參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，通過檢測結(jié)直腸癌BRAF V600E 是否存在突變有助于個體化制訂治療方案及判斷預(yù)后。

綜上所述，ddPCR 與ARMS 均可用于檢測結(jié)直腸癌的BRAF V600E 突變，ddPCR 有更高的檢測效能。