方賢磊 曾麗平 李 娜 向 莎 伍世揮 盧小敏 張 暢 梁 露

1.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，湖南懷化 418000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南懷化 418000

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第四位，死亡率第二位，嚴(yán)重危害人們的健康［1］。探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治方法具有重要的臨床和現(xiàn)實(shí)意義。腫瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)方面，與機(jī)體的免疫應(yīng)答密切相關(guān)［2-4］。輔助性T（Th）細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，其主要分為兩類，即Th1 細(xì)胞亞群和Th2 細(xì)胞亞群，其中Th1 細(xì)胞主要分泌γ 干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-12、IL-17 等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，在腫瘤發(fā)生及抗腫瘤免疫過程中起重要作用，而Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、和IL-10 等細(xì)胞因子，通過刺激B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白來介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)［5-7］。正常狀態(tài)下，機(jī)體Th1 和Th2 細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，以保證機(jī)體發(fā)揮正常的免疫功能，而近年來有研究顯示［8-10］，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，Th1/Th2 細(xì)胞之間的平衡很可能被打破，變成Th2 細(xì)胞占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致免疫應(yīng)答失衡。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌組織中Th1 細(xì)胞因子IFN-γ 與Th2 細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)情況，并探討其與患者臨床分期進(jìn)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集2016 年1 月—2018 年8 月湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的61 例結(jié)直腸癌患者的腸組織標(biāo)本為結(jié)直腸癌組，其中男37 例，女24 例；年齡20～68 歲，平均（50.0±8.2）歲。按照臨床分期，將其分為臨床Ⅰ期16 例，臨床Ⅱ期20 例，臨床Ⅲ期15 例，臨床Ⅳ期10 例。另收集各期患者距離癌組織邊緣外10 cm的癌旁組織各5 例（共20 例）為對照組。本研究經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究的患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

所有樣本行組織切片，經(jīng)HE 染色做病理確診，并綜合臨床分期，然后采用免疫組織化學(xué)法（SP 法）檢測各組組織中IFN-γ（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TA320356）和IL-4（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TA320372）的表達(dá)情況，DAB 顯色以后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕黃色顆粒為陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析每張圖片中陽性染色部分的平均積分光密度值（MIOD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSDt 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ 和IL-4 在不同分期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4 在結(jié)直腸癌病灶組織和癌旁腸黏膜組織中均有表達(dá)，主要分布在胞質(zhì)內(nèi)。腫瘤分期越高，IFN-γ 表達(dá)的陽性程度越弱；腫瘤分期越高IL-4 的陽性越強(qiáng)。見圖1～2（封四）。

圖1 IFN- y在不同分期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況(SP ,400x)

圖2 IL- 4在不同分期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況(SP，400x)

2.2 不同分期結(jié)直腸癌組織中IFN-γ、IL-4 MIOD 值比較

臨床Ⅳ期結(jié)直腸癌組織IL-4 MIOD 值高于臨床Ⅰ～Ⅲ期及對照組，臨床Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織IL-4 MIOD 值高于臨床Ⅰ期及對照組，臨床Ⅰ期結(jié)直腸癌組織IL-4 MIOD 值高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；臨床Ⅳ期結(jié)直腸癌組織IFN-γ MIOD值低于臨床Ⅰ～Ⅲ期及對照組，臨床Ⅲ期結(jié)直腸癌組織IFN-γ MIOD 值低于臨床Ⅰ～Ⅱ期及對照組，臨床Ⅱ期結(jié)直腸癌組織IFN-γ MIOD 值低于臨床Ⅰ期及對照組，臨床Ⅰ期結(jié)直腸癌組織IFN-γ MIOD 值低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。

表1 不同分期結(jié)直腸癌組織中IFN-γ 和IL-4 MIOD 值比較（）

表1 不同分期結(jié)直腸癌組織中IFN-γ 和IL-4 MIOD 值比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與Ⅰ期比較，☆P ＜0.05；與Ⅱ期比較，△P ＜0.05；與Ⅲ期比較，#P ＜0.05。IL-4：白細(xì)胞介素-4；IFN-γ：γ 干擾素

3 討論

腫瘤相關(guān)的免疫反應(yīng)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程中起著重要作用［7-9］。CD4+T 細(xì)胞是效應(yīng)T 細(xì)胞的重要組成部分，根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同分為Th1、Th2、Treg 和Th17 細(xì)胞。Th1 細(xì)胞可分泌IFN-γ，激活B 淋巴細(xì)胞，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是細(xì)胞免疫的關(guān)鍵參與者［10］。Th2 細(xì)胞可通過獨(dú)立于吞噬活性的機(jī)制殺死細(xì)胞外病原體，可分泌IL-4、IL-5 等細(xì)胞因子激活補(bǔ)體免疫反應(yīng)，激活巨噬細(xì)胞，并能刺激B 細(xì)胞增強(qiáng)IgG 抗體的產(chǎn)生［5,11］。Th1/Th2 細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制或功能失調(diào)可導(dǎo)致癌癥進(jìn)展，晚期癌癥患者普遍存在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能受損，其免疫應(yīng)答主要為Th2 細(xì)胞［12］。侵襲性更強(qiáng)的腫瘤患者Th1/Th2 細(xì)胞比值較低，且Th1 細(xì)胞顯性反應(yīng)的患者5 年存活率更高，癌癥的復(fù)發(fā)率更低［13-14］。因此，Th1/Th2 細(xì)胞平衡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估的生物標(biāo)志。

本研究探討了結(jié)直腸癌組織中Th1 細(xì)胞因子IFN-γ 和Th2 細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá)情況及臨床意義，發(fā)現(xiàn)癌組織中細(xì)胞因子IFN-γ 表達(dá)減少，而IL-4表達(dá)增加，與Walker 等［15］同類研究結(jié)果基本一致。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了IFN-γ 和IL-4 的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中IFN-γ的表達(dá)水平較對照組明顯降低，腫瘤分期高，IFN-γ 表達(dá)水平低；而結(jié)直腸癌組織中IL-4 的表達(dá)較對照組明顯增高，腫瘤分期高，IL-4 的表達(dá)水平高，提示在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在Th1/Th2細(xì)胞的失衡現(xiàn)象，平衡隨腫瘤進(jìn)展逐漸向Th2 細(xì)胞亞群偏移。Gonzalez-Gugel 等［16］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者外周血中細(xì)胞因子IL-6、IL-4 和IFN-γ 的表達(dá)水平與臨床病理分期相關(guān)，且Th1 型細(xì)胞比例變化不大而Th2 細(xì)胞比例顯著增多。這些研究結(jié)果提示Th1/Th2 細(xì)胞因子在體內(nèi)的不平衡表達(dá)可以作為判斷結(jié)直腸癌患者免疫功能轉(zhuǎn)換、病情狀態(tài)及預(yù)后情況的生物學(xué)指標(biāo)。

盡管本研究初步證明結(jié)直腸癌組織存在Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)失衡，且與患者的臨床病理分期相關(guān)。但由于方法學(xué)、樣本量等方面的限制，本研究結(jié)果仍需設(shè)計(jì)更好、樣本量更大的臨床隊(duì)列研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究只停留在現(xiàn)象層面，對于Th1/Th2 細(xì)胞因子在腫瘤組織中失衡的具體原因、轉(zhuǎn)化規(guī)律及在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體生物學(xué)作用仍需深入研究，同時(shí)也是下一步的研究目標(biāo)。Th1/Th2 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡及細(xì)胞因子分泌情況是目前腫瘤發(fā)生機(jī)制和腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，Th1 型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在抑制腫瘤細(xì)胞生長過程中起著重要作用。維持Th1/Th2 細(xì)胞的正常平衡狀態(tài)，誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞的分化，有助于癌癥患者免疫功能的恢復(fù)，促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高抗腫瘤治療效果。