吳穎旭， 程杰坤， 李 樂(lè)△， 陶厚權(quán)

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院本科藥劑14級(jí)； 2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014； 3. 浙江省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310014)

病理性心肌肥厚(cardiac hypertrophy,CH)是心臟對(duì)各種病理有害刺激如心肌缺血、高血壓等適應(yīng)性反應(yīng)的結(jié)果；如CH持續(xù)進(jìn)展，則加大心肌耗氧量，促進(jìn)心肌纖維化和功能損害，誘發(fā)心力衰竭、猝死[1]。所以，積極有效防治病理性CH臨床價(jià)值重大。

杭白菊屬“浙八味”藥材之一，其能舒張血管、抗氧化、抑制血管平滑肌增生和凋亡；杭白菊總黃酮是其重要活性成分,可對(duì)抗心肌缺血,清除氧自由基,降血壓[2]；70年代發(fā)現(xiàn)其制劑對(duì)心紋痛有效率達(dá)83.0%[2]。但杭白菊提取物(chrysanthemum flower extract，CFE)防治CH國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用異丙腎上腺素(isoprenaline,Iso)構(gòu)建CH小鼠模型，觀察CFE影響CH作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 藥品與試劑

JCR小鼠，清潔級(jí)，雄性48只，體重(19.4±2.6)g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：SCXK(浙)2016-0014。CFE，本研究所植化室提取并鑒定(總黃酮含量≥60%)；鹽酸Iso注射液(上海禾木制藥有限公司，171209)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)及總超氧化歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、蛋白定量試劑盒-南京建成生物工程研究所；Angiotensin(AngⅡ) ELISA 試劑盒(201708)和Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)ELISA 試劑盒(201708)-上海哈靈生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

RJ-酶標(biāo)儀(美國(guó)BD 公司)；722N分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)；KDC-2046低溫離心機(jī)(中科大創(chuàng)新股份有限公司)；Qwin圖像分析軟件(德國(guó)Leica)。

1.3 動(dòng)物分組及處理

健康雄性JCR小鼠48只，隨機(jī)分為4組(n=12): 對(duì)照組、單純藥物處理組(CFE組)、CH模型組(Iso組)和 CH模型+藥物處理組 (CFE+Iso 組)；Iso 組和CFE+Iso 組每天一次i.hIso(3 mg/kg)，以構(gòu)建小鼠CH模型，對(duì)照組和 CFE組每天一次i.h同體積生理鹽水，連續(xù)14 d；同時(shí)i.h在4 h后，CFE組和 CFE+Iso組每天一次灌胃CFE(200 mg/kg) ，對(duì)照組和Iso 組每天灌胃同體積的生理鹽水；28 d后取小鼠心臟， 檢測(cè)全心質(zhì)量指數(shù)(heart mass index, HMI)、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index, LVMI)、心臟質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度比值(heart weight/tibia length, HW/TL)、心肌纖維化程度、心肌SOD、GSH、MDA水平和左心室組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、血管緊張素II(Ang II)水平。

1.4 心肌組織學(xué)參數(shù)檢測(cè)

測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量后處死，取小鼠心臟及右下肢脛骨, PBS 漂洗，濾紙吸干，分別測(cè)體質(zhì)量、全心質(zhì)量、左室質(zhì)量及脛骨長(zhǎng)度，計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)，左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index， LVMI)=左室質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)，心臟質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度(heart weight/tibial length， HW/TL)比值。

1.5 心肌纖維化程度的檢測(cè)

小鼠左室4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，Masson 染色拍照，Qwin軟件分析各組心肌纖維化程度。

1.6 左室組織 T-SOD、GSH 和 MDA 水平檢測(cè)

取左室稱量剪碎，加冷生理鹽水成10% 組織勻漿，4℃ 3 000 r/min，離心10 min 得上清液。分別按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清液中T-SOD、GSH 和MDA 水平。

1.7 左室組織 cAMP和Ang Ⅱ含量的檢測(cè)

用 ELISA 法測(cè)10% 左室勻漿上清液cAMP和 AngⅡ含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)上清液總蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠組織學(xué)指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，Iso組小鼠 LVMI、HMI 和 HW/TL升高(P<0.01)，而CFE處理后，降低CFE+Iso組小鼠的 LVMI、HMI 和 HW/TL 值(P<0.01);與對(duì)照組相比，CFE組小鼠的 LVMI、HMI 和HW/TL 值無(wú)顯著差異(表 1)。

GroupLVMI(mg/g)HMI(mg/g)HW/TL(mg/mm)Control3.02±0.233.93±0.275.85±0.33CFE3.05±0.243.92±0.295.85±0.25Iso model4.89±0.28??5.86±0.36??8.28±0.38??CFE+Iso4.28±0.25?# 5.32±0.32??#6.67±0.30??##

LVMI: Left ventricular mass index; HMI: Heart mass index; HW/TL: Heart weight/tibial length

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

2.2 各組小鼠心肌纖維化程度比較

Masson染色，與對(duì)照組比較，Iso 組小鼠心肌纖維化程度明顯(P<0.01)，而CFE處理后，CFE+Iso組小鼠心肌纖維化程度下降(P<0.01);與對(duì)照組比較，CFE組小鼠心肌纖維化程度無(wú)明顯變化(圖1)。

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIso model group

2.3 各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，Iso組小鼠心肌GSH、 SOD 水平下降，MDA水平增加；而CFE處理后，明顯改善CFE+Iso組的上述指標(biāo)(P<0.01);與對(duì)照組比較，CFE組小鼠上述指標(biāo)均無(wú)明顯差異(表 2)。

GroupGSH(μmol/mg·prot)MDA(mmol/mg·prot)T-SOD(mmol/mg·prot)Control6.21±0.924.56±0.69158±31CFE6.23±0.894.60±0.71161±33Iso model 5.02±0.67??6.43±0.86??73±17??CFE+Iso 5.79±0.72?#4.99±0.72?##119±24??##

GSH: Glutathione； MDA: Malondialdehyde； T-SOD: Total-superoxide dismutase

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsIso model group

2.4 各組小鼠心肌cAMP 和 AngⅡ含量比較

與正常組比較，Iso模型組 cAMP 和AngⅡ含量均增多(P<0.01，表3)。與Iso模型組比較，CFE+Iso組的上述指標(biāo)降低 (P<0.01或P<0.05)。

GroupcAMP(nmol/mg·prot)AngⅡ(pg/mg·prot)Control1.74±0.3183.12±12.53CFE1.75±0.30 5.85±0.25Iso model 2.48±0.39??95.72±13.02?CFE+Iso1.77±0.31##79.38±10.51#

CFE： Chrysanthemum flower extract

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

3 討論

Iso加強(qiáng)心肌收縮力，增多心肌耗氧量，增加心肌蛋白合成而誘導(dǎo)CH[3]。本研究顯示，CFE處理后，CFE+Iso組小鼠LVMI、HMI 和 HW/TL 值下降,說(shuō)明CFE預(yù)防性給藥對(duì)Iso誘導(dǎo)CH有保護(hù)作用。心肌纖維化是心肌重構(gòu)誘發(fā)心衰和猝死的重要高危因素[1]，預(yù)防性給予CFE后，CFE+Iso 組小鼠心肌纖維化程度明顯下降。提示，CFE能有效抑制Iso 所致心肌纖維化發(fā)展。

研究證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷與CH發(fā)病密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體活性氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)，氧化應(yīng)激損傷就易發(fā)生；當(dāng)體內(nèi) SOD、GSH等抗氧化物質(zhì)減低時(shí)，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化， 促使MDA 堆積，參與CH進(jìn)程[4]。本研究發(fā)現(xiàn)， CFE處理后，CFE+Iso 組小鼠SOD,GSH和MDA指標(biāo)水平翻轉(zhuǎn)， 提示CFE提高機(jī)體抗氧化能力，緩解Iso誘導(dǎo)小鼠心肌損傷。

基礎(chǔ)與臨床研究已公認(rèn)，交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮能導(dǎo)致心肌cAMP增加，最終造成CH、纖維化；也能促進(jìn)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 活化，分泌Ang II；Ang II 可與心肌細(xì)胞膜上血管緊張素II受體結(jié)合，活化 G蛋白激活磷脂酶 C，產(chǎn)生三磷酸肌醇和二?；视?；前者釋放細(xì)胞內(nèi) Ca2+，后者激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，PKC轉(zhuǎn)入核內(nèi)再激活PLC-PKC/MAPK 家族等多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致CH[5]。本研究中，CFE+Iso組小鼠心肌cAMP、AngⅡ含量不同程度下降。顯示CFE能降低心肌交感神經(jīng)、RAAS 興奮性，有效對(duì)抗CH。

綜上所述，本研究觀察到CFE能改善Iso 誘導(dǎo)的小鼠CH的心臟狀況，其機(jī)制可能與抗氧化、抑制心肌纖維化進(jìn)展、降低心肌cAMP、AngⅡ水平有關(guān)，為CFE用于CH的臨床研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究資料。