劉志禮，宜建英，王丹丹，鄧慧婷，劉樹(shù)業(yè)

1 天津市第三中心醫(yī)院/天津市肝膽研究所/天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津300170；2 天津市第一中心醫(yī)院

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小群具有自我更新和無(wú)限增殖能力的細(xì)胞。大量的研究[1]顯示，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥，特別是在腫瘤的復(fù)發(fā)、異質(zhì)性的形成等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，腫瘤干細(xì)胞維持自我更新的分子調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類(lèi)基本不具備蛋白編碼功能且長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本。越來(lái)越多的證據(jù)[2]表明，lncRNAs在機(jī)體內(nèi)通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、調(diào)控染色質(zhì)重塑和競(jìng)爭(zhēng)性吸附微小RNAs等多種方式參與了胚胎發(fā)育、器官形成、X染色質(zhì)失活、腫瘤發(fā)生等重要的生理和病理學(xué)過(guò)程。KCNQ1OT1作為一種lncRNA，參與了乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展。Li等[3]利用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明，KCNQ1OT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附microRNA-504從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。Hu等[4]研究證實(shí)，KCNQ1OT1可以通過(guò)對(duì)miR-7-5p/ABCC1軸進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥。上述研究表明，KCNQ1OT1在肝癌細(xì)胞增殖、耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但是KCNQ1OT1是否參與調(diào)控肝癌干細(xì)胞的自我更新仍需要進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)檢測(cè)KCNQ1OT1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，觀(guān)察下調(diào)KCNQ1OT1表達(dá)對(duì)肝癌干細(xì)胞自我更新能力以及Hippo-YAP通路關(guān)鍵靶基因表達(dá)的影響，探討KCNQ1OT1調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制，旨在為以KCNQ1OT1為靶點(diǎn)的肝癌診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本、肝癌細(xì)胞系及試劑 收集從2018年12月～2019年12月期間在天津市第三中心醫(yī)院經(jīng)組織病理檢查確診的肝癌患者20例，肝癌患者均接受肝癌切除術(shù)治療，術(shù)中留取癌組織及癌旁組織，液氮中保存。患者均簽署知情同意書(shū)，天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究臨床樣本的使用。實(shí)驗(yàn)中所使用的肝癌細(xì)胞系(Huh7、SMMC7721、Hep3B)、人永生化正常肝上皮細(xì)胞L02以及293T細(xì)胞均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，1%青/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，N2和B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胰酶和膠原酶Ⅳ購(gòu)自美國(guó)Sigam Aldrich公司，生長(zhǎng)因子bFGF和EGF購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，CD13和CD133流式抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，通過(guò)小干擾RNA技術(shù)抑制KCNQ1OT1表達(dá)的KCNQ1OT1敲降質(zhì)粒KCNQ1OT1 shRNA及其對(duì)照質(zhì)粒sh-Ctrl、引物均由中國(guó)上海吉瑪公司合成，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及超低吸附六孔培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 肝癌組織與癌旁組織、肝癌細(xì)胞系與人永生化正常肝上皮細(xì)胞中KCNQ1OT1的檢測(cè) 采用RT-PCR法。使用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)擴(kuò)增。引物的序列如下：KCNQ1OT1正向引物為5′-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT-3′,反向引物為5′-TGGGGTGAGGGATCTGAA-3′；GAPDH正向引物為5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,反向引物為5′-GGACTCCACGACGTACTCA3′。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示組織或細(xì)胞中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 肝癌干細(xì)胞分選分組、KCNQ1OT1 shRNA轉(zhuǎn)染及自我更新能力觀(guān)察和Hippo-YAP通路靶基因mRNA檢測(cè)

1.3.1 肝癌干細(xì)胞分選分組、KCNQ1OT1 shRNA轉(zhuǎn)染 使用胰酶和膠原酶Ⅳ將Huh7細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次后，重懸在500 μL FACS緩沖液中，加入5 μL CD13-PE和5 μL CD133-APC抗體，充分混勻后4℃避光孵育30 min，孵育結(jié)束后棄上清再用PBS洗滌2次，用流式分選儀篩選獲得CD13+CD133+的肝癌干細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌干細(xì)胞，記為A組；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌干細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1 shRNA慢病毒載體，建立KCNQ1OT1穩(wěn)定敲降細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染sh-Ctrl的肝癌干細(xì)胞為對(duì)照，采用RT-PCR法篩選KCNQ1OT1相對(duì)表達(dá)量顯著降低的肝癌干細(xì)胞，記為B組；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KCNQ1OT1穩(wěn)定敲降細(xì)胞系，使用Lipofectamine 3 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染YAP1過(guò)表達(dá)載體，采用RT-PCR法篩選YAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高的KCNQ1OT1穩(wěn)定敲降細(xì)胞系，記為C組。

1.3.2 各組肝癌干細(xì)胞自我更新能力觀(guān)察 ①各組肝癌干細(xì)胞成球能力觀(guān)察。使用胰酶和膠原酶Ⅳ將各組肝癌干細(xì)胞分別消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，分別計(jì)數(shù)5 000個(gè)細(xì)胞接種到超低吸附的6孔板中，用包含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、N2和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔一天更換一次并輕輕晃動(dòng)以防止細(xì)胞貼壁，2周后觀(guān)察成球情況，計(jì)算各組肝癌干細(xì)胞的成球率。②各組肝癌干細(xì)胞克隆形成能力觀(guān)察。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。將各組肝癌干細(xì)胞分別消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分別取300個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)基每3天更換1次，14天后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗兩遍后，使用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染液染色15 min后，計(jì)數(shù)各組克隆形成數(shù)。③各組肝癌干細(xì)胞增殖能力觀(guān)察。采用CCK8實(shí)驗(yàn)。將各組肝癌干細(xì)胞分別消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，分別取100 μL接種于96孔板中,在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的OD值。

1.3.3 各組肝癌干細(xì)胞中Hippo-YAP通路靶基因Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。參照方法“1.2”，檢測(cè)各組肝癌干細(xì)胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：Yap1正向引物為5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,反向引物為5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；Birc5正向引物為5′-CCAGATGACGACCCCATAGAG-3′,反向引物為-TTGTTGGTTTCCTTTGCAATTTT-3′；Foxm1正向引物為5′-CGTCGGCCACTGATTCTCAAA-3′,反向引物為5′-GGCAGGGGATCTCTTAGGTTC-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織與癌旁組織、肝癌細(xì)胞系與人永生化正常肝上皮細(xì)胞中KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量比較 肝癌組織與癌旁組織中KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量分別為4.947±0.944、1.161±0.471，兩者相比，P<0.05，提示KCNQ1OT1在肝癌組織中高表達(dá)。Huh7、SMMC7721、Hep3B細(xì)胞中KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量分別為2.933±0.216、1.423±0.125、2.490±0.137，L02細(xì)胞中KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量為1.033±0.191，Huh7、SMMC7721、Hep3B細(xì)胞中KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量與L02細(xì)胞相比，P均<0.05，提示KCNQ1OT1在肝癌細(xì)胞系Huh7、SMMC7721、Hep3B中高表達(dá)。

2.2 各組自我更新能力和Hippo-YAP通路靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2.1 各組肝癌干細(xì)胞自我更新能力比較 ①各組肝癌干細(xì)胞成球能力比較。A、B、C組肝癌干細(xì)胞成球率分別為3.010%±0.003%、1.063%±0.002%、2.100%±0.002%，其中B組與A、C組相比，P均<0.05。②各組肝癌干細(xì)胞克隆形成能力比較。A、B、C組肝癌干細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為76.667±8.505、34.667±4.803、51.333±5.686，其中B組與A、C組相比，P均<0.05。③各組肝癌干細(xì)胞增殖能力比較。A組肝癌干細(xì)胞24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.503±0.042、0.817±0.116、1.313±0.168、1.613±0.158，B組肝癌干細(xì)胞24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.385±0.051、0.545±0.095、0.785±0.150、0.965±0.140,C組肝癌干細(xì)胞24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.483±0.065、0.737±0.086、1.127±0.163、1.353±0.140，其中B組與A、C組相比，P均<0.05。

2.2.2 各組肝癌干細(xì)胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 A組肝癌干細(xì)胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.957±0.114、0.953±0.138、0.940±0.089，B組肝癌干細(xì)胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.333±0.086、0.417±0.096、0.210±0.056，C組肝癌干細(xì)胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.873±0.137、0.897±0.136、0.820±0.123，其中B組與A、C組相比，P均<0.05。

3 討論

肝癌是目前臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，肝癌的發(fā)病多起源于肝臟的慢性炎癥，與酗酒、長(zhǎng)期高脂飲食、接觸黃曲霉毒素尤其是與感染慢性病毒性肝炎等密切相關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，從2000年到2016年肝癌死亡率增加了43%。我國(guó)的發(fā)病人數(shù)約占全球發(fā)病人數(shù)的55%，死亡率位居惡性腫瘤的第二位，且發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)。肝癌的異質(zhì)性大且易復(fù)發(fā)，這與肝癌組織中殘留的一小群具有自我更新和再次成瘤能力的肝癌干細(xì)胞密切相關(guān)。因此，深入研究肝癌干細(xì)胞自我更新的分子調(diào)控機(jī)制，尋找新型的分子靶標(biāo)，以期提高臨床的治療效果，改善患者的預(yù)后水平，是當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

LncRNAs通過(guò)多個(gè)層面包括表觀(guān)遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，廣泛參與機(jī)體的生理和病理學(xué)過(guò)程，其在很多腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。如lncRNA MCM3AP-AS1通過(guò)與miR-194-5p直接結(jié)合充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNAs(ceRNAs)，導(dǎo)致miR-194-5p的靶基因FOXA1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，并抑制凋亡[5]。HOXD-AS1作為一種抑癌lncRNA，通過(guò)將PRC2募集到HOXD3的啟動(dòng)子區(qū)域從而抑制HOXD3的轉(zhuǎn)錄,使MAPK/AKT信號(hào)通路失活，進(jìn)而使得結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力降低[6]。TINCR通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-125b，使得miR-125b的靶基因Snail-1表達(dá)升高從而造成乳腺癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗耐藥。此外，最新的一些研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs還參與腫瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)。Fu等[7]報(bào)道，LncRNA HOTTIP通過(guò)與HOXA9結(jié)合間接激活Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)人胰腺癌干細(xì)胞的自我更新。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)，HAND2-AS1通過(guò)招募INO80染色體重塑復(fù)合體到BMPR1A的啟動(dòng)子區(qū)域，激活了BMP信號(hào)通路，進(jìn)而參與肝癌干細(xì)胞的自我更新。KCNQ1OT1是一種由RNA聚合酶Ⅱ編碼、長(zhǎng)度為91.5 kb、中等穩(wěn)定的核苷酸轉(zhuǎn)錄本。最初發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在貝克威思-威德曼綜合征中表達(dá)異常，隨后研究陸續(xù)報(bào)道KCNQ1OT1調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和耐藥，但KCNQ1OT1是否影響肝癌干細(xì)胞的自我更新未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，KCNQ1OT1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，這與Li等[3]報(bào)道的KCNQ1OT1在肝癌組織中高表達(dá)相一致。進(jìn)一步敲降KCNQ1OT1后發(fā)現(xiàn)，肝癌干細(xì)胞的成球能力、克隆形成能力和增殖能力明顯降低，上述結(jié)果表明KCNQ1OT1參與肝癌干細(xì)胞的自我更新。為深入研究KCNQ1OT1促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新的作用機(jī)制，我們首先通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin(靶基因Myc、Kiaa、Tiam)、NF-κB(靶基因Vegf、Mmp2、Twist1)、Hippo-YAP(靶基因Yap1、Birc5、Foxm1)、Notch(靶基因Hes1、Nrarp、Hey1)和Hedgehog(靶基因Gli3、Patched、Gli1)通路在多種腫瘤干細(xì)胞的自我更新過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用，上述信號(hào)通路的失活能夠明顯的抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新，腫瘤的增殖及克隆形成[9]。Qu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，lncARSR可以通過(guò)與YAP1結(jié)合，使YAP1去磷酸化，促進(jìn)YAP1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合，增加干性基因的表達(dá)從而參與腎癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)。Li等[11]研究表明，B4GALT1-AS1通過(guò)募集HuR來(lái)增強(qiáng)YAP1的轉(zhuǎn)錄活性從而促進(jìn)骨肉瘤干細(xì)胞的自我更新。而在KCNQ1OT1敲降的肝癌干細(xì)胞中，Hippo-YAP通路上3個(gè)關(guān)鍵靶基因的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組顯著降低，這提示KCNQ1OT1可能通過(guò)作用于Hippo-YAP通路促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的自我更新。隨后，挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了YAP1是KCNQ1OT1調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，KCNQ1OT1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，抑制KCNQ1OT1的表達(dá)可能通過(guò)Hippo-YAP信號(hào)通路影響肝癌干細(xì)胞的自我更新能力。KCNQ1OT1有望成為肝癌臨床診療的新型干預(yù)靶點(diǎn)。