白學(xué)慧 吳貴宏 邵維治 羅 琴 張洪波③

(1 云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 云南瑞麗678600;2 瑞麗海關(guān)綜合技術(shù)中心 云南瑞麗678600)

粉蚧科（Pseudococcidae）昆蟲是一類重要的農(nóng)林害蟲，全世界超過2000種［1]。據(jù)Waller等報(bào)道，國外為害咖啡花、葉的粉蚧科害蟲有南洋臀紋粉蚧Planococcus lilacinusCockerell、肯尼亞粉蚧P. kenyaeLe Pelley、柑橘臀紋粉蚧P.citriRisso、 雙條拂粉蚧Ferrisia virgataCockerell 等4 種；為害咖啡根部的粉蚧科害蟲有Benedictycoccina omataHambleton、Capitisetella migransGreen、Cataenoccus podagrosusGreen、Coccidella globoculusHambleton、菠蘿灰 粉 蚧Dysmicoccus brevipesCockerell、D.debregeasiaeGreen、 香蕉灰粉蚧D. grassiLeonardi、D. probrevipesMorrison、D. radicisGreen、D. subterreusWilliams、D. tex-ensisTinsley、 格 林 蟻 粉 蚧Formicococcus greeniVayssière、印度蟻粉蚧F. robustusEzzat & McConnell、咖啡荒粉蚧Geococcus coffeaeGreen、Neochavesia caldsiaeBalachowsky、N.eversiBeardsley、斐濟(jì)簇粉蚧Paraputo leveriGreen、柬埔寨臀紋粉蚧P. angkorensisTakahashi、柑橘臀紋粉蚧P. citriRisso、P. fungicolaWatson & Cox、南洋臀紋粉蚧P. lilacinusCockerell、P. radicumWatson & Cox、橘小粉蚧Pseudococcus cryptusHempel、P. pseudocitriculusBetrem、Pseudorhizoecus proximusGreen、Puto antioquensis（Murillo）、P.mexicanusCockerell、 美 洲 根 粉 蚧Rhizoecus americanusHambleton、R. arabicusHambleton、R. caladiiGreen、咖啡根粉蚧R. coffeaeLaing、R. divaricatusHambleton、R. elotiGiard、R. falciferKunckel d'Herculais、R.nemoralisHambleton、Ripersiella andensis

Hambleton、柑橘土粉蚧R. kondonisKuwana 等37種［2]。中國報(bào)道，為害咖啡葉部的粉蚧有雙條拂粉蚧F. virgataCockerell［3]，為害咖啡根部的粉蚧有廣布蟻粉蚧F. polysperes（Williams）、南洋臀紋粉蚧P. lilacinusCockerell、大洋臀紋粉蚧P. minorMaskell［4]和印度牦粉蚧Planococcoides robustus［5]。2018年筆者在云南省瑞麗咖啡種植園發(fā)現(xiàn)有粉蚧為害，并采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)對該粉蚧進(jìn)行了鑒定，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

粉蚧標(biāo)本采自云南省瑞麗市咖啡（Coffea arabica）植株地上部分，其中10頭雌成蟲用于形態(tài)學(xué)鑒定，6 頭（雌蟲3 頭，若蟲3 頭）用于分子生物學(xué)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

玻片標(biāo)本的制作參照張江濤［4]方法，玻片顯微形態(tài)特征觀察使用Leica DM5000B 雙筒光學(xué)顯微鏡觀測、拍照。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增

采用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen，Duesseldorf，Germany）試劑盒進(jìn)行粉蚧DNA 提取。以文獻(xiàn)報(bào)道的粉蚧通用引物組合PCOF（5’-CCTTCAACTAATCATAAAAATATYAG-3’）/LepR1 （5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’）［6]，擴(kuò) 增P.citri的COI基因條形碼序列區(qū)段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：模板DNA 1.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.4 μL （10 mmol/L），上游引物和下游引物各0.4 μL （10 μmol/L），Taq 酶0.4 μL （2.5 U/μL），ddH2O 19.4 μL，總體積為25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃2 min；94 ℃40 s，45 ℃50 s，72 ℃50 s，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃40 s，51 ℃50 s，72 ℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。擴(kuò)增反應(yīng)在VeritiTM96-well Thermal Cycler （ABI-Applied Biosystems，USA）上進(jìn)行。

1.2.2.2 電泳檢測及序列測定

取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 在含有Gold viewII 的1.0%瓊脂糖凝膠上以100 V 電泳分離45 min，然后，以凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。最后，將經(jīng)電泳檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.2.3 序列處理與分析

以MEGA 5.22［7]和Dna SP5.10.01［8]軟件進(jìn)行序列校正、拼接、多序列比對和單倍型多樣性分析，并對COI基因所有的單倍型進(jìn)行Blast，分析其與NCBI 數(shù)據(jù)庫中同名種的序列一致性；然后，將測樣本序列整合NCBI 中同名種和臀紋粉蚧屬的其他粉蚧的序列（每種單倍型選用1 條序列），以NCBI 中的扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsisTinsley 序列（GeneBank 登錄號：AB858432））作為外群，用MEGA5.22 軟件，采用HKY＋G＋I(xiàn) 模型，以最大似然法maximum likelihood（ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對各分支進(jìn)行1000次Bootstrap檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 為害特點(diǎn)

P.citri雌成蟲和若蟲吸食咖啡葉片、嫩稍、花和漿果（圖1），造成咖啡葉片變黃枯萎、該蚧蟲排泄的蜜露可引發(fā)煤污病，影響咖啡的光合作用。

2.2 形態(tài)特征

雌成蟲（活體）蟲體扁平，橢圓形，背面稍向上隆起，表面蓋有白色蠟粉，體節(jié)明顯，蟲體邊緣有17 對細(xì)長蠟絲，尾端蠟絲稍長（圖2-A）。雌成蟲（玻片）呈橢圓形，長1.96～2.52 mm，寬1.19～1.90 mm（圖2-B）。觸角全長410.5～429.6 μm，共8 節(jié)，第1 節(jié)長52.0～61.5 μm，第2 節(jié)長52.0～60.0 μm，第3 節(jié)長53.0～59.0 μm，第4 節(jié)長28.5～36.5 μm，第5 節(jié)長32.0～38.5 μm，第6節(jié)長30.5～38.0 μm，第7節(jié)長46.0～48.5 μm，第8節(jié)長97.5～102.5 μm（圖3-A），眼位于觸角之后近體緣，呈錐狀?？谄靼l(fā)達(dá)。足細(xì)長發(fā)達(dá)，前足基節(jié)長60.5～66.5 μm，轉(zhuǎn)節(jié)＋腿節(jié)長216.0～255.0 μm，脛節(jié)+跗節(jié)長239.5～259.0 μm；中足基節(jié)長72.5～82.0 μm，轉(zhuǎn)節(jié)＋腿節(jié)長256.0～270.0 μm，脛節(jié)＋跗節(jié)長265.0～301.0 μm；后足基節(jié)長86.5～94.0 μm，轉(zhuǎn)節(jié)＋腿節(jié)長275.5～296.0 μm，脛節(jié)＋跗節(jié)長295.0～329.0 μm；后足基節(jié)、脛節(jié)有多個(gè)透明孔。爪粗壯，無爪齒。腹臍橫橢圓形，位于第3、第4 腹節(jié)腹板間，有節(jié)間褶。肛環(huán)位于背末呈圓形，長約85.5 μm，寬75.5～82.5 μm，有6 根長環(huán)毛，長110.5～130.5 μm。尾瓣發(fā)達(dá)，腹面有硬化棒，刺孔群18 對。末對刺孔群C18有2 根錐刺，2～3 根附毛和多個(gè)三格腺（圖3-B）。管腺長6.5～8.5 μm，寬3.0～3.5 μm，頭部和胸部第8 刺孔群附近管腺20～50 個(gè)，在腹部體緣成群（圖3-C）。與張江濤［4]、湯祊德［9]描述的柑橘臀紋粉蚧P.citri雌成蟲形態(tài)特征基本一致。因此，該蟲鑒定為柑橘臀紋粉蚧P. citri。

2.3 分子鑒定

2.3.1 PCR擴(kuò)增及序列分析

以不同蟲態(tài)的P. citri為對象，以COI基因條形碼區(qū)段的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無論成蟲還是若蟲均可擴(kuò)增出長度約為710 bp 的單一靶標(biāo)片段（圖4）。擴(kuò)增片段經(jīng)雙向測序、拼接、比對和剪切處理后，各靶標(biāo)片段大小均為666 bp。單倍型分析結(jié)果表明，6頭P. citri的序列完全相同，為同一單倍型；將獲得的P. citriCOI基因5’端的所有單倍型序列與NCBI 中P. citri的相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析，其核苷酸序列一致性為99%～100%；與其它種相應(yīng)核苷酸序列的一致性＜98%。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

整合NCBI 中臀紋粉蚧屬粉蚧的序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，本研究中的P. citri與NCBI 中的P. citri聚為一支，分支支持率為90%（圖5）。而且，臀紋粉蚧屬的其他物種亦各自聚為一支，并共同構(gòu)成臀紋粉蚧屬分支。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

柑橘臀紋粉蚧P. citri寄主植物很多，報(bào)道有83 科239 種。我國報(bào)道的寄主植物有41 科85種，其中茜草科Rubiaceae 植物有：梔子Gardenia jasminoides、 白 紙 扇Mussaenda es-quiroill、團(tuán)花Neolamarckia cadamba、龍船花Ixora chinensis等4 種［4]。目 前 國 內(nèi) 尚 未 見P.citri為害咖啡的報(bào)道。P. citri是東南亞最為常見的粉蚧之一。由于該蚧腹面管腺數(shù)量常有不同程度的變異，極易與P. minor混淆。印度、菲律賓、越南和印度尼西亞有P. citri為害咖啡根部的記錄，但Williams 在其對東方粉蚧的綜述中未引用印度或菲律賓的材料，并認(rèn)為是將P. minor誤認(rèn)為P. citri［2]。本研究通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法將該粉蚧鑒定為P. citri，鑒定結(jié)果可靠真實(shí)。

據(jù)郭俊等［10]報(bào)道，P. citri在云南瑞麗檸檬園的發(fā)生、分布與溫濕度相關(guān)。7～10月份進(jìn)入雨季，濕度大、溫度高該蟲在地上部分危害較重，4～6月份濕度較低，該蟲在地下根部危害較重，并采用10%吡蟲啉可濕性粉劑2000 倍液在P.citri低齡蟲期，進(jìn)行灌根，取得了較好的防治效果。本研究發(fā)現(xiàn)，P.citri可為害咖啡地上部分，尚未發(fā)現(xiàn)其為害咖啡根部，是由于本研究調(diào)查地點(diǎn)和時(shí)間范圍的影響，還是該蚧不為害咖啡根部有待進(jìn)一步研究，同時(shí)，P. citri、F. polysperes、P. lilacinus、P. minor和Pl. robustus等蚧蟲在云南咖啡園的分布發(fā)生情況及流行動(dòng)態(tài)還需作系統(tǒng)研究，以便制定合理的咖啡園蚧蟲防治方案。

3.2 結(jié)論

形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定結(jié)果表明，該為害咖啡的粉蚧為柑橘臀紋粉蚧P.citri（Risso），隸屬于半翅目（Hemiptera） 蚧總科（Coccoidea） 粉蚧科（Pseudococcidae） 臀紋粉蚧屬（Planococcus）。