姚瑰瑋 劉辰鵬 楊永兆 李 娟 林明琴③

(1 海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南海口571119;2 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 海南?？?71119)

翅莖白粉藤（Cissus hexangularisThorel ex Planch.） 是 葡萄科 （Vitaceae） 白粉藤屬（CissusL.）植物，別名五儉藤、山坡瓜藤、攔河藤、散血龍（海南）等，是海南等熱帶和亞熱帶地區(qū)盛產(chǎn)的特色黎族藥用植物，廣泛分布于海南中部、西部及西南部［1-2]。民間常用其藤莖搗敷或煎水洗，治療跌打損傷、刀刃傷，具有顯著的抗菌消炎、清熱解毒等功效［3-5]。姚瑰瑋等［6]研究表明，翅莖白粉藤中含有糖類、苷類、黃酮類、酚類、蒽醌類、香豆素、生物堿及揮發(fā)油等化學(xué)成分。劉元等［7]研究表明，翅莖白粉藤中含有白藜蘆醇。黃酮類化合物及白藜蘆醇等成分正是藥物抗氧化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，該類成分大量存在于醇提液中。目前國內(nèi)外未見翅莖白粉藤總黃酮抗氧化作用的研究報道。

本文采用乙醇氧化損傷模型，通過檢測小鼠血清中MDA（丙二醛）、GSH（還原型谷胱甘肽）含量，SOD（超氧化物歧化酶）及GSH-Px（谷胱甘肽過氧化物酶）活力來評價翅莖白粉藤乙醇浸膏的體內(nèi)抗氧化活性，并探討其作用機(jī)制，為尋找天然抗氧化劑以及翅莖白粉藤的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

翅莖白粉藤藤莖樣本采自海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院中藥教研室曾念開教授鑒定為翅莖白粉藤（Cissus hexangularisThorel ex Planch）。標(biāo)本保存在海南醫(yī)學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

1.1.2 動物

SPF 級雄性昆明種健康成年小鼠50 只，體重25～30 g，購自海南省藥物研究所，動物合格證號：No.46002100000692。

1.1.3 試劑

PEG400 （AR，上海阿拉丁生物科技有限公司）、冰醋酸、無水乙醇、NaCl 均為國產(chǎn)分析純試劑，購買于西隴科學(xué)股份有限公司；丙二醛（MDA）測試盒（A003-1）、還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（A006-2-1）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（A001-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）測試盒（A005）均由南京建成生物工程研究所提供。試驗(yàn)用水為超純水。

1.1.4 儀器

U-2900 型雙光束紫外可見分光光度計（日本株式會社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所）；AE100 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；HYQ-2121A渦旋混勻器（美國精騏有限公司）；DK-8D三溫三控水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；RJ-TDL-40B-Ⅱ低速臺式大容量離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司司）；TGL-16G 臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 供試樣品的制備

1.2.1.1 浸膏的制備

將翅莖白粉藤藤莖洗凈、40℃烘干、粉碎過40 目篩，保存?zhèn)溆谩悠贩勰┡c75%乙醇按1∶5（V∶V）的比例以85℃水浴回流提取3 h，過濾烘干至恒重，陰涼干燥處保存。所得浸膏即為翅莖白粉藤乙醇提取物，平均浸膏得率為15.0%［6]。

1.2.1.2 供試液的配制

取翅莖白粉藤乙醇浸膏干燥膏體，研磨成細(xì)粉狀，以13.75%PEG400 溶液為潛溶劑，將翅莖白粉藤乙醇浸膏配制成含生藥量分別為1.829、3.657、7.315 g/kg 的混懸液，必要時可微微加熱以加速溶解。臨用前配制，每次灌胃前搖勻后使用。

1.2.2 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 造模方法

參照國食藥監(jiān)保化［2012]107 號《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》［8]，高、中、低劑量組給予不同濃度的供試液0.2 mL/10 g，模型對照組和空白對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃15 d，末次灌胃后，模型對照組和3個劑量組禁食16 h（過夜），然后1次性灌胃給予50%乙醇12 mL/（kg·bw），6 h 后取材，空白對照組不作處理，不禁食取材。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及樣品采集

將50 只昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分成5 組，分別為空白組，模型組，高、中、低劑量組，各組均飼予基礎(chǔ)飼料，自由飲水；高劑量組以7.315 g/kg 的翅莖白粉藤乙醇混懸液灌胃給藥，中劑量組灌胃3.657 g/kg 混懸液，低劑量組灌胃1.829 g/kg 混懸液，模型對照組和空白對照組給予同體積溶劑，每日灌胃一次，連續(xù)灌胃15 d，末次灌胃后，模型組對照組和高、中、低劑量組禁食16 h（過夜），然后1 次性灌胃給予50%乙醇12 mL/（kg·bw）；6 h 后摘取眼球取血，空白對照組不作處理，不禁食取血；4000 r/min 離心10 min后取血清，-80 ℃凍存待測；摘取眼球取血后立即脫頸處死，迅速摘取肝臟和腎臟，用生理鹽水洗凈、吸干水分并稱重，計算臟器系數(shù)［9]。臟器系數(shù)計算公式為：

1.2.3 指標(biāo)檢測

觀察和記錄各組小鼠在給藥后的外觀表現(xiàn)。MDA 含量測定：取小鼠血清，參照MDA 試劑盒說明書操作，采用紫外分光光度法測定血清MDA 含量；GSH 含量測定：取小鼠血清，參照GSH 試劑盒說明書操作，采用紫外分光光度法測定血清GSH 含量；SOD 活力測定：取小鼠血清，參照T-SOD 試劑盒說明書操作，采用紫外分光光度法測定血清SOD活力值；GSH-Px 活力測定：取小鼠血清，參照GSH-Px試劑盒說明書操作，采用紫外分光光度法測定血清GSH-Px活力值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

先采用Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，再用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠外觀體征的影響

與空白組小鼠比較，模型組，低、中、高劑量組小鼠的食欲、活動情況、體毛、糞便均正常，無明顯差異，無死亡，表明翅莖白粉藤乙醇浸膏無明顯毒性。

2.2 翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠肝腎系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是指實(shí)驗(yàn)動物某臟器的重量與其體重之比，與機(jī)體的衰老程度相關(guān)，能宏觀反映動物機(jī)體氧化損傷的程度［9]。翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠臟器系數(shù)的影響見表1。

表1 翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠肝腎系數(shù)的影響

從表1中的數(shù)據(jù)可知，與空白組比較，模型組腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)均顯著下降（p＜0.05），表明乙醇使小鼠肝臟和腎臟受到了一定損傷。高、中、低劑量組腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)與模型組相比無顯著差異（p＞0.05），這可能與造模時間短有關(guān)。

2.3 翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠血清中MDA、GSH、SOD、GSH-Px的影響

丙二醛（MDA）是體內(nèi)氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。MDA含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷程度［10-11]。還原型谷胱甘肽（GSH）是組織中主要的非蛋白質(zhì)巰基化合物，也是最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基，維持紅細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞正常生長發(fā)育及細(xì)胞免疫等多種重要生理功能［12]。超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)重要的抗氧化酶，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，該酶可以清除機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷［13]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，能特異性地催化GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，從而阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少過氧化產(chǎn)物生成，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［13]。翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠血清中MDA、GSH、SOD、GSH-Px 含量的影響結(jié)果見表2。

與空白組比較，模型組小鼠血清中MDA含量顯著升高（p＜0.01）、GSH 含量及SOD、GSH-Px 活力顯著降低（p＜0.01），顯示造模成功。與模型組比較，高、中、低3 個劑量組小鼠血清中的MDA 含量均顯著降低（p＜0.01 或p＜0.05），且在不同劑量組中MDA含量下降呈現(xiàn)濃度依賴性。說明翅莖白粉藤乙醇浸膏可以對抗乙醇氧化損傷造成的小鼠血清MDA 含量升高，從而降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，對生物膜具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用隨給藥濃度的增大而增強(qiáng)。

與模型組比較，高、中、低劑量組小鼠血清中的GSH 含量均顯著升高（p＜0.01 或p＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性，表明翅莖白粉藤乙醇浸膏可以提高被乙醇氧化損傷的小鼠血清中的GSH 含量，清除體內(nèi)多余自由基，從而保護(hù)受損細(xì)胞。與模型組比較，低劑量組和中劑量組小鼠血清中的SOD活力均顯著升高（p＜0.05），而高劑量組小鼠血清中的SOD 活力較模型組有極顯著差異性（p＜0.01），表明一定濃度的翅莖白粉藤乙醇浸膏可以顯著提高被乙醇氧化損傷的小鼠血清中SOD 活力，清除氧自由基，修復(fù)因被氧化而損傷的細(xì)胞。與模型組比較，低劑量組和中劑量組小鼠血清中的GSH-Px 活力均顯著升高（p＜0.05），而高劑量組小鼠血清中的GSH-Px 活力較模型組有極顯著差異性（p＜0.01）。表明一定濃度的翅莖白粉藤乙醇浸膏可以顯著提高被乙醇氧化損傷的小鼠血清中的GSH-Px 活力，減少過氧化產(chǎn)物的堆積，在一定程度上緩解乙醇對小鼠造成的氧化損傷。

表2 翅莖白粉藤乙醇浸膏對小鼠血清MDA、GSH、SOD、GSH-Px的影響

3 結(jié)論

翅莖白粉藤乙醇浸膏具有明顯的體內(nèi)抗氧化活性，其作用機(jī)制可能與降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、防止有害物質(zhì)堆積、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活性、清除自由基等密切相關(guān)。翅莖白粉藤乙醇浸膏的成分復(fù)雜多樣，具有體內(nèi)抗氧化活性的成分可能是單體化合物，也可能是多種化學(xué)物質(zhì)共同作用的效應(yīng)。對于翅莖白粉藤乙醇浸膏體內(nèi)抗氧化活性確切的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。