李 楊 鐘明明 廖 一 謝鳳英 孫禹凡 齊寶坤

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆親脂蛋白(Lipophilic protein，LP)的主要成分是油體蛋白和磷脂，它是油體的原始成分，且具有較強(qiáng)的表面活性。LP作為一種營養(yǎng)價值較高的植物蛋白被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。但在加工中天然大豆蛋白的功能會受到一定程度的破壞，尤其是當(dāng)溶液的pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)的各種功能都會大幅度下降，因此常對蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男蕴幚韀2]。研究人員通過多種方式，如加熱、超聲、微波、超高壓等技術(shù)手段，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能特性[3-6]，使其表現(xiàn)出更好的功能特性。近年來，天然大豆蛋白改性成為研究熱點(diǎn)，如引入磷脂等生物小分子或多糖等生物大分子物質(zhì)，使其與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，復(fù)合體系的形成對大豆蛋白的功能性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。

羥丙基甲基纖維素(Hydroxypropyl methylce-llulose，HPMC)是一種可食用性纖維素，其健康無毒，且具有良好的水溶性、成膜性和較強(qiáng)的表面活性，可以控制表面壓力并改善薄膜粘彈性[7]，可作為穩(wěn)定劑用于乳液制備。作為一種兩性離子表面活性劑，HPMC可以通過結(jié)合的方式使LP的表面活性發(fā)生改變，且它們之間的交互作用會影響LP的功能性質(zhì)。已有研究通過加入多糖改變蛋白連續(xù)相的流變特性和界面膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)體系的穩(wěn)定性[8-10]。文獻(xiàn)[11]研究表明，多糖連接到蛋白質(zhì)表面，部分結(jié)構(gòu)可以伸入兩相中形成有效的乳液保護(hù)層，降低界面張力，增強(qiáng)液滴間靜電排斥或空間位阻。但未能清晰地解釋超高壓處理等物理加工方式對蛋白質(zhì)-多糖交互作用的影響。

本文通過超高壓處理改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，促進(jìn)柔性結(jié)構(gòu)展開、剛?cè)嵝詤^(qū)域重排、非極性基團(tuán)暴露，同時改變蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖與蛋白質(zhì)分子的鍵合，使蛋白-多糖復(fù)合物有效提高乳液界面活性、構(gòu)象穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性；同時，研究超高壓處理對LP-HPMC復(fù)合程度及復(fù)合物功能性質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)研究超高壓處理?xiàng)l件對LP-HPMC復(fù)合物形成的影響，以期為超高壓技術(shù)運(yùn)用于LP-HPMC復(fù)合產(chǎn)品和其他蛋白與HPMC復(fù)合的食品加工過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農(nóng)43)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；羥丙基甲基纖維素(Ⅰ型，粘度：30 mPa·s)，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；葵花籽油，市售；氯化鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸，北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX UTL2000型高壓均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型有限公司；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；Mastersizer2000型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；DELTAVISION OMX SR型超分辨顯微鏡，德國徠卡公司；UV-5100型高性能紫外可見分光光度計(jì)，上海讓奇儀器科學(xué)有限公司；F4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大豆親脂蛋白提取

大豆LP組分的分離由文獻(xiàn)[12]的方法經(jīng)修改后使用。大豆磨粉，過60目篩，正己烷脫脂制備低變性大豆脫脂粉，在70℃干熱處理2 h，此時氮溶指數(shù)降至75%。50 g干熱處理后的脫脂豆粉加入到400 mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值到8.0。在20℃下攪拌1 h后3 000g離心10 min。分離上清液并加入 10 mol/L Na2SO3,然后用H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.8，3 000g離心10 min，再用H2SO4調(diào)節(jié)上清液pH值至5.0，并在55℃下處理15 min。然后加入50 mol/L NaCl并用NaOH調(diào)節(jié)pH值到5.5，3 000g離心10 min，沉淀即為LP組分。

1.3.2LP-HPMC復(fù)合物的超高壓處理

將HPMC與LP以1∶5(質(zhì)量比)的比例混合于100 mL錐形瓶中，LP質(zhì)量濃度為5 mg/mL，室溫(20℃)攪拌后靜置12 h。次日，將混合溶液分成5組，密封后將其中4組放入聚乙烯袋內(nèi)，置于高壓容器中。在25℃條件下，對每組溶液分別進(jìn)行200、300、400、500 MPa加壓處理，每種壓力條件下的連續(xù)加壓時間為10 min。每組測量3次，取平均值，凍干部分備用。

1.3.3LP-HPMC復(fù)合物乳液的制備

用pH值為7.4的10 mol/L磷酸鹽緩沖溶液制備由HPMC穩(wěn)定的LP水包油乳液。通過將適量的經(jīng)不同超高壓處理的 LP-HPMC復(fù)合物溶液中加入25%的葵花籽油，在10 000 r/min條件下均質(zhì)3 min后形成乳液，4℃條件下貯藏。

1.3.4三維熒光光譜

采用熒光光譜儀并參照文獻(xiàn)[13]的方法測定LP-HPMC溶液的三維熒光光譜，將制備好的LP-HPMC溶液稀釋50倍后，取一定量置于比色皿中測定得到三維熒光結(jié)構(gòu)圖。初始激發(fā)波長為280 nm，掃描波長為200～500 nm，譜帶寬度10 nm，掃描16條曲線。

1.3.5紅外光譜(FTIR)

將乳液直接進(jìn)行凍干，凍干后的樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 mg與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片進(jìn)行紅外光譜測定。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了減少水蒸氣的影響干擾，用干燥的N2持續(xù)注入測量室。測定時波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1，得到的紅外吸收曲線采用peak fitting軟件和高斯曲線擬合，分析蛋白在不同均質(zhì)壓力的情況下二級結(jié)構(gòu)含量的變化[14]。

1.3.6粒徑和電位

使用Mastersizer2000型粒徑電位儀進(jìn)行LP-HPMC溶液粒徑分布和ζ-電勢的測量。在裝入PCS8501型比色杯之前，用10 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)將樣品稀釋至0.1%。所有測量均在25℃下進(jìn)行3次。對于分散體使用1.450的折射率，對于連續(xù)相(10 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.4)使用1.331的折射率[15]。

1.3.7溶解性

參照文獻(xiàn)[16]的方法稍作修改測定LP溶解性，取凍干粉末溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度約為10 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，攪拌1 h使樣品溶解，靜置2 min后，將靜置后的上層溶液倒入離心管中離心15 min (10 000g)。取上清液2 μL稀釋10倍，采用BCA(Bicinchonininc acid)法測定蛋白質(zhì)含量。以牛清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白的含量占樣品中總的蛋白含量百分比。

1.3.8表面疏水性

參照文獻(xiàn)[17]的方法稍作修改，采用ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸銨)作為熒光探針測定蛋白質(zhì)表面疏水性。分別稱取 0.025 g不同凍干樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液(10 mol/L，pH值7.4)中，在室溫條件下攪拌1.0 h后離心(10 000g，30 min)，取上清液用BCA法測定蛋白濃度，并用磷酸鹽緩沖液(10 mol/L，pH值7.4)依次稀釋蛋白，使其質(zhì)量濃度在0.005～0.1 mg/mL之間，將所得梯度的上清液溶液與8.0 mmol/L ANS以體積比100∶1混合，靜置3 min后測其熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長497 nm，夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度制圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水值。

1.3.9乳化活性與乳化穩(wěn)定性

樣品乳化性及乳化穩(wěn)定性測定參照文獻(xiàn)[18]的方法。在0 min和10 min時從乳液樣品底部分別取樣50 μL，經(jīng)SDS(十二烷基磺酸鈉)稀釋200倍，充分混合后在500 nm處測定吸光度，記錄為A，以SDS做空白對照。乳化活性指數(shù)(Emulsification activity, EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsification stability, ESI)分別表示為

(1)

(2)

式中E1——乳化活性指數(shù)，m2/g

E2——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

T——活性常數(shù)，取2.303

N——稀釋倍數(shù)，取200

θ——油相體積分?jǐn)?shù)，取25%

L——比色杯厚度，取1 cm

C——乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，取5 mg/mL

A0、A10——乳狀液在0、10 min的吸光度

1.3.10微觀結(jié)構(gòu)測定

參照文獻(xiàn)[19]的方法稍加修改以用于乳液微觀結(jié)構(gòu)觀察。用0.01 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖溶液將樣品適度稀釋，取一滴適度稀釋的乳液放置在載玻片上，并用蓋玻片固定，在40倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個平行樣的平均值，結(jié)果采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行處理，采用ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維熒光分析

三維熒光是在二維基礎(chǔ)上衍生出的新型熒光分析手段，主要用于描述蛋白的熒光強(qiáng)度在兩種維度上的變化。它在二維的基礎(chǔ)上增加了測量的維數(shù)，更加便于直觀觀測熒光強(qiáng)度狀態(tài)的變化，增加了光譜的分辨率[20]。

LP和HPMC之間的相互作用很大程度上影響LP的物化性質(zhì)，從而對LP進(jìn)一步應(yīng)用產(chǎn)生影響，可以使用三維熒光分析來研究。圖1顯示在不同超高壓條件處理下LP-HPMC復(fù)合物的三維熒光圖譜，實(shí)驗(yàn)組前期研究證明LP的激發(fā)波長和發(fā)射波長都在220 nm處，證明其發(fā)色基團(tuán)主要出現(xiàn)在此波長下；當(dāng)LP與HPMC相互結(jié)合時在激發(fā)波長280～480 nm范圍內(nèi)，出現(xiàn)第2個峰，證明二者發(fā)生相互作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，不同超高壓處理的LP-HPMC復(fù)合物熒光強(qiáng)度均高于未經(jīng)超高壓處理的復(fù)合物，且當(dāng)超高壓處理?xiàng)l件為400 MPa時，220 nm處熒光強(qiáng)度幾乎為零，這可能是由于在此均質(zhì)壓力下LP的發(fā)色基團(tuán)被埋在復(fù)合物的疏水區(qū)域中，LP熒光強(qiáng)度在復(fù)合物的存在下發(fā)生猝滅，暫時無法被識別。這也可以從側(cè)面體現(xiàn)400 MPa壓力下LP溶解性得到很大提升，增大與HPMC反應(yīng)量更有利于LP-HPMC復(fù)合物的進(jìn)一步利用。

圖1 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物三維熒光圖譜Fig.1 Three-dimensional fluorescence of LP-HPMC complex under different ultra-high pressure treatment conditions

2.2 紅外光譜分析

圖2 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物 紅外光譜Fig.2 IR spectrum of LP-HPMC composite under different ultra-high pressure treatment conditions

另外，從二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(表1)分析，超高壓處理可以提高α-螺旋相對含量，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)也發(fā)生不同程度的改變，400 MPa時α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量最高，說明LP的二級結(jié)構(gòu)在一定程度上被破壞，柔性結(jié)構(gòu)增加，分子由有序結(jié)構(gòu)變得無序。高壓均質(zhì)處理后可能破壞了二級結(jié)構(gòu)中的氫鍵作用，使蛋白質(zhì)分子展開、二級結(jié)構(gòu)破壞、蛋白質(zhì)不同程度改變和伸展，從而影響LP與HPMC的結(jié)合程度。

2.3 粒徑和電位分析

圖3(圖中不同字母表示電位差異顯著)為不同超高壓處理?xiàng)l件形成的LP-HPMC復(fù)合物溶液的粒徑和電位。粒徑越小、越均勻越有利于乳液的穩(wěn)定；同樣電位的絕對值越大表明乳液穩(wěn)定性越好[24]。粒徑圖可以看出，未經(jīng)超高壓處理的LP-HPMC溶液出現(xiàn)明顯的分峰，超高壓處理后的溶液都只有一個粒徑峰值，這與二者的結(jié)合程度有關(guān)，超高壓可提高LP與HPMC的結(jié)合度。均質(zhì)壓力為400 MPa時，LP-HPMC復(fù)合溶液粒徑體積分?jǐn)?shù)和平均粒徑(218 nm)都最小，同時電位絕對值(16.4 mV)最大，說明此均質(zhì)壓力條件有利于LP-HPMV復(fù)合溶液的進(jìn)一步開發(fā)利用。結(jié)合共聚焦圖和電位變化

表1 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)相對含量Tab.1 IR spectrum of LP-HPMC composite under different ultra-high pressure treatment conditions

注：同一列不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

可知400 MPa處理的LP與HPMC形成復(fù)合物的乳液形狀規(guī)則穩(wěn)定，表面凈電荷較多，這主要是由于在不同壓力下蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生變化，同時HPMC可以改變?nèi)橐罕砻骐姾梢约霸黾咏缑鎸雍穸?，增?qiáng)乳滴間的空間排斥力和親水性，改善復(fù)合物溶液的穩(wěn)定性[25]。

圖3 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物 粒徑和電位Fig.3 Particle size and potential of LP-HPMC complex under different ultra-high pressure treatment conditions

2.4 溶解性和表面疏水性分析

溶解性是蛋白質(zhì)的重要指標(biāo)，可直接影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[26]，而LP由于含大量磷脂，其溶解性較差，HPMC添加可輕微改善LP溶解性，但效果不明顯，輔以超高壓處理可顯著提高LP溶解度，400 MPa時溶解度達(dá)到最大值41.1%。在超高壓處理過程中發(fā)生的均質(zhì)化效應(yīng)會產(chǎn)生強(qiáng)大的均質(zhì)力，這會增加LP-HPMC疏水區(qū)域的局部溫度和壓力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的去折疊，進(jìn)而使其內(nèi)部親水性氨基酸殘基暴露，并且由于超高壓處理期間促使LP中的不溶性沉淀物與HPMC相互作用形成可溶性聚集體，因此溶解度得到顯著提升。表面疏水值表示蛋白質(zhì)分子表面上存在的疏水基團(tuán)數(shù)量，蛋白質(zhì)的疏水值越大溶解度越小。圖4(圖中不同字母表示溶解度差異顯著)可以看出，隨著壓力的增大，表面疏水值呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，與溶解度結(jié)果一致，即在400 MPa表面疏水值最小，為57 832，此時溶解度最大。

圖4 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物 溶解度和表面疏水值Fig.4 Solubility and surface hydrophobicity of LP-HPMC complex under different ultra-high pressure treatment conditions

2.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

EAI表示的是LP-HPMC復(fù)合物形成油-水界面的能力，HPMC結(jié)合了LP后在水相中的溶解能力以及HPMC能夠強(qiáng)烈吸附在油-水界面形成乳化層的能力；ESI是指乳狀液形成小液滴的穩(wěn)定能力[27]。因此，EAI及ESI是表征LP-HPMC復(fù)合物功能性質(zhì)最有力的指標(biāo)之一。由圖5(圖中不同字母表示EAI差異顯著)可知，隨著均質(zhì)壓力的增大，EAI與ESI都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在400 MPa均質(zhì)壓力的情況下，LP-HPMC乳液EAI都表現(xiàn)出最大值，超高壓力為400 MPa時對于乳液體系最有利，與前文得出的結(jié)論一致。而在500 MPa時，EAI與ESI都呈現(xiàn)出最小值，這可能是由于均質(zhì)壓力過高會使LP內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，影響其溶解度，從而減少LP-HPMC復(fù)合物的形成量，進(jìn)而使乳液EAI和ESI呈現(xiàn)最小值。這與三維熒光和溶解度數(shù)據(jù)結(jié)果一致，再次證明超高壓力為400 MPa時不但有利于LP與HPMC充分結(jié)合，此條件形成的乳液乳化活性與乳化穩(wěn)定性也最佳。

圖5 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC復(fù)合物 乳液EAI和ESIFig.5 EAI and ESI of LP-HPMC composite emulsion under different ultra-high pressure treatment conditions

2.6 微觀結(jié)構(gòu)分析

光學(xué)顯微鏡經(jīng)常用于分析液體微觀結(jié)構(gòu)，能夠直觀地反映出溶液顆粒大小、分散狀況及產(chǎn)生的不穩(wěn)定現(xiàn)象。圖6是不同復(fù)合物所形成溶液的微觀結(jié)構(gòu)圖及平均粒徑數(shù)據(jù)，隨著超高壓處理壓力的增大，溶液粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。由圖6a可知，未經(jīng)超高壓處理的LP-HPMC溶液液滴粒徑較大(1 644 nm)且分布不均勻，出現(xiàn)了液滴聚集，這主要是由于此時LP的溶解性較差，LP和HPMC發(fā)生分離，沒有較好地復(fù)合。LP與HPMC相互作用形成的界面膜不夠穩(wěn)定，易發(fā)生絮凝或聚集現(xiàn)象。圖6b～6d可以觀察到較為均勻的蛋白液滴分布，同時也存在較小的液滴，這主要是由于不同超高壓處理的LP與HPMC復(fù)合物穩(wěn)定的液體粒徑相對較小且經(jīng)均質(zhì)力作用呈球形分布。并且復(fù)合物隨壓力的增加液滴變小、分布均勻。這可能是由于復(fù)合物在空氣-水界面形成更加致密的膜結(jié)構(gòu)[25-26]，LP-HPMC復(fù)合物經(jīng)超高壓處理后柔韌性和乳化性較好，形成液滴結(jié)構(gòu)更加均勻，改善了液滴凝聚和絮凝現(xiàn)象，說明超高壓處理得到的LP-HPMC復(fù)合物能更好地穩(wěn)定乳液。然而，壓力過大依舊不利于穩(wěn)定復(fù)合物的形成，圖6e顯示500 MPa壓力處理下的液滴團(tuán)聚效應(yīng)強(qiáng)于200～400 MPa，說明壓力過高時反而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集無法伸展，不利于穩(wěn)定乳液的形成。

圖6 不同超高壓處理?xiàng)l件下LP-HPMC光學(xué)顯微結(jié)果Fig.6 LP-HPMC optical microscope under different ultra-high pressure treatment conditions

3 結(jié)束語

采用超高壓處理探究均質(zhì)壓力對LP-HPMC相互作用及復(fù)合物功能性質(zhì)的影響，結(jié)果表明：適宜的超高壓處理可以顯著提高LP與HPMC的復(fù)合程度，同時提升功能性質(zhì)，如溶解性、表面疏水性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性；400 MPa改性的柔性大豆LP與HPMC復(fù)合物表現(xiàn)出較好的粒徑分布，相對于未經(jīng)超高壓處理的LP-HPMC復(fù)合物溶液分散性更好；超高壓處理改善了LP二級構(gòu)象，隨著壓力的增加，α-螺旋相對含量先升高、后降低，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量先降低、再升高；400 MPa時，α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量最高，LP構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，此時LP有序構(gòu)象的組成、柔性結(jié)構(gòu)的展開影響蛋白質(zhì)整體構(gòu)象的柔韌性，更易與HPMC形成功能特性較好的復(fù)合物。