郭桂珍，韓榮勝，王有清，劉慶春

急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）是神經(jīng)內(nèi)科最常見(jiàn)的危重癥之一，其致死率和致殘率均較高[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新增卒中患者近200萬(wàn)例，其中接近80%為缺血性卒中[2-3]。因此，進(jìn)一步探討AIS可能的分子標(biāo)志物顯得十分重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度為19～25 bp的小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。miRNA-148a定位于7號(hào)染色體7p15．2，與炎癥免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。近期研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA-148a可調(diào)節(jié)組織的缺血預(yù)適應(yīng)損傷，并與創(chuàng)傷性腦損害的病理過(guò)程有關(guān)[6-7]。然而，關(guān)于miRNA-148a在AIS中的表達(dá)水平及臨床價(jià)值尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析AIS患者外周血血清的miRNA-148a水平及臨床資料，以探討miRNA-148a在AIS發(fā)病和病情評(píng)估方面的潛在價(jià)值；同時(shí)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA-148a可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 本研究為前瞻性研究，選取2017年10月-2018年4月青海省第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的AIS患者42例為觀察組，其中男性25例，女性17例，平均年齡62．4±9．3歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～85歲，首次發(fā)病且發(fā)病至入院時(shí)間＜12 h；②AIS的診斷符合2014年中國(guó)急性缺血性卒中診治指南[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并出血性卒中、顱內(nèi)血管畸形等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。虎诤喜⑿慕g痛、心肌梗死、感染、炎癥免疫性疾病、惡性腫瘤、血液病等；③嚴(yán)重心力衰竭、嚴(yán)重肝腎功能不全者；④近期口服免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物。選取于本院體檢中心接受體檢且確定無(wú)全身疾病者42例為健康對(duì)照組，根據(jù)年齡和性別與觀察組進(jìn)行1∶1匹配。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1．2 資料收集 收集年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史等基本臨床資料，記錄AIS患者發(fā)病至入院的時(shí)間，并根據(jù)顱內(nèi)MRI結(jié)果計(jì)算梗死灶最大層面直徑。其中，直徑＜1．5 cm為腔隙性腦梗死，1．5～5．0 cm為中等面積腦梗死，＞5．0 cm為大面積腦梗死[8]。收集患者生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，包括LDL-C、HDL-C、入院血糖、Cr、hs-CRP等。

所有研究對(duì)象至醫(yī)院后即刻抽取其肘靜脈血5 mL于非抗凝管中，3000 g×15 min離心，取上清液分裝于離心管中并儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，以便統(tǒng)一檢測(cè)miRNA-148a水平。采用Trizol裂解液提取血清樣本的總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)進(jìn)行基因片段擴(kuò)增，儀器為Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀。其中，miRNA-148a的上游引物序列為5'-TCAGTGCACTACAGAACTTTGT-3'，下游引物序列為5'-GCTGTCAACGATACGCT ACGT-3'。U6核小分子RNA作為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACAT ATA-3'，下游引物序列為5'-TTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）。miRNA-148a的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1．3 公共數(shù)據(jù)分析 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：// www．ncbi．nlm．nih．gov/geo）下載數(shù)據(jù)集GSE55937[9]。該數(shù)據(jù)集共收集24例AIS患者和24例健康對(duì)照者的外周血樣本，采用Affymetrix公司的Multispecies miRNA-3 Array芯片進(jìn)行檢測(cè)，平臺(tái)號(hào)為GPL16384。下載數(shù)據(jù)為CEL格式，采用R軟件的affy包進(jìn)行背景校正、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和log2轉(zhuǎn)換后用于后續(xù)分析。

1．4 生物信息學(xué)分析 采用miRDB、miRTar Base和TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)miRNA-148a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，其結(jié)果取交集后得到最終的靶基因。采用Cytoscape 3．6．0軟件構(gòu)建miRNA-148a的靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然后，利用DAVID 6．8在線工具對(duì)靶基因進(jìn)行富集分析，包括基因本體論（gene ontology，GO）-生物學(xué)過(guò)程、京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路，其結(jié)果用超幾何分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 6．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)檢測(cè)，所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，用表示，其組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，其組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析miRNA-148a水平與AIS患者臨床資料之間的關(guān)系。繪制miRNA-148a對(duì)AIS診斷的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，以曲線下面積反映其診斷效能。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 miRNA-148a在急性缺血性卒中患者中的表達(dá) AIS組患者入院時(shí)的血清miRNA-148a相對(duì)表達(dá)量為0．76±0．23，而健康對(duì)照組的miRNA-148a相對(duì)表達(dá)量為1．02±0．21，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5．392，P＜0．001）。ROC曲線分析提示，miRNA-148a診斷AIS的曲線下面積為0．79（95%CI0．70～0．89，P＜0．001）（圖1）。

2．2 miRNA-148a與急性缺血性卒中患者臨床資料的相關(guān)性 根據(jù)AIS患者miRNA-148a相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)將其分為低水平組（＜0．74，n=21）和高水平組（≥0．74，n=21），結(jié)果表明兩組患者的腦梗死面積、HDL-C和hs-CRP水平存在顯著差異（表1）。Spearman相關(guān)性分析提示AIS患者的miRNA-148a水平與腦梗死面積（r=-0．34，P=0．03）和hs-CRP（r=-0．43，P=0．005）均負(fù)相關(guān)，而與其他臨床資料無(wú)關(guān)。

2．3 GSE55937數(shù)據(jù)集中miRNA-148a的表達(dá)在公共數(shù)據(jù)集G SE55937中，A IS患者的miRNA-148a相對(duì)表達(dá)量為1．93±0．46，而對(duì)照組的miRNA-148a相對(duì)表達(dá)量為2．52±1．00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2．64，P=0．011）。ROC曲線分析表明，miRNA-148a診斷AIS的曲線下面積為0．69（95%CI0．54～0．84，P=0．022）（圖2）。

2．4 生物信息學(xué)分析 miRDB、miRTarBase和TargetScan 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)預(yù)測(cè)到58個(gè)miRNA-148a的靶基因，包括WNT10B、DNMT1等（圖3）。GO和KEGG富集分析提示，這些靶基因主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞凋亡的正向調(diào)控、神經(jīng)元分化以及凋亡相關(guān)的線粒體膜蛋白插入的正向調(diào)控等，主要涉及的信號(hào)通路包括叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路等（表2）。

表1 不同miRNA-148a水平組急性缺血性卒中患者的臨床資料比較

圖2 GSE55937數(shù)據(jù)集中miRNA-148a的表達(dá)情況（左）及其診斷急性缺血性卒中的受試者工作曲線（右）

圖3 miRNA-148a的靶基因預(yù)測(cè)（左）及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（右）

3 討論

目前，AIS的發(fā)病率在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)仍居高不下，嚴(yán)重威脅人類健康并加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找AIS有效的生物標(biāo)志物有重要臨床意義。外周血miRNA相對(duì)穩(wěn)定、不易降解且其檢測(cè)方法較為敏感、準(zhǔn)確，可作為臨床疾病潛在診斷和病情鑒別的新型標(biāo)志物[10]。既往研究提示，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能上起到重要作用[11]。miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系也是近年來(lái)的熱點(diǎn)研究問(wèn)題，而腦血管疾病患者的外周血miRNA也存在不同程度的差異表達(dá)。例如，Lili Zeng等[12]的研究發(fā)現(xiàn)AIS患者外周血的miRNA-210表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降，尤其在發(fā)病后第7天和第14天更為明顯，可能是診斷AIS的潛在標(biāo)志物之一。而Jingru Wang等[13]近期的研究提示，miRNA-148/152家族的另一成員miRNA-148b可通過(guò)影響Wnt信號(hào)通路蛋白，從而參與AIS后的腦組織修復(fù)過(guò)程。本研究通過(guò)分析AIS患者的臨床數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，均發(fā)現(xiàn)miRNA-148a在AIS患者中水平降低，且在一定程度上可反映腦梗死嚴(yán)重程度和炎癥水平。

表2 miRNA-148a靶基因的富集分析

通過(guò)生物信息學(xué)分析，本研究共預(yù)測(cè)到58個(gè)miRNA-148a的靶基因，包括WEN10B、DNMT1等。有研究表明，miRNA-148a可通過(guò)與WEN10B直接結(jié)合，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路[14]。而DNMT1是miRNA-148a的重要的靶基因[15]。抑制DNMT1則有助于保護(hù)腦缺血性損傷[16]。以上這些靶基因主要涉及細(xì)胞凋亡、FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt通路等分子機(jī)制。近年來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為，腦缺血核心區(qū)以壞死為主，而缺血程度較輕的半暗帶則以凋亡性死亡為主，因此細(xì)胞凋亡也是腦缺血造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制[17]。FoxO信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)和凋亡等過(guò)程[18]。Deyuan Li等[19]研究表明，F(xiàn)oxO信號(hào)通路蛋白FOXO3a與腦缺血缺氧模型大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而PI3K-Akt通路則是調(diào)節(jié)AIS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制之一，應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002可降低磷酸化的Akt水平，增加腦梗死體積[20]。因此，miRNA-148a可能通過(guò)調(diào)控WEN10B、DNMT1等靶基因，影響細(xì)胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信號(hào)通路，從而參與AIS的發(fā)生發(fā)展。

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE55937數(shù)據(jù)集中，AIS組miRNA-148a的表達(dá)水平也明顯低于對(duì)照組，且miRNA-148a對(duì)AIS具有一定的診斷效能，表明本研究的結(jié)論相對(duì)穩(wěn)定。此外，本研究利用多個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA-148a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，其預(yù)測(cè)的結(jié)果也相對(duì)可靠。但本研究仍有以下不足：①臨床數(shù)據(jù)的樣本較小且為單中心研究，因此可能導(dǎo)致結(jié)果有一定的偏倚；②所采集的樣本均為外周血血清樣本，不能明確腦組織中miRNA-148a的表達(dá)情況，但如前所述，外周血miRNA相對(duì)穩(wěn)定，其檢測(cè)方法較為敏感準(zhǔn)確；③因本研究重點(diǎn)關(guān)注miRNA-148a在AIS早期的變化，故未對(duì)其進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，不能明確AIS患者發(fā)病后miRNA-148a的動(dòng)態(tài)水平。

綜上所述，A IS患者發(fā)病早期的血清miRNA-148a降低，在一定程度上可反映腦梗死程度和炎癥水平，可能涉及細(xì)胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信號(hào)通路。因此，miRNA-148a可能在AIS的診斷及病情評(píng)估方面具有一定參考價(jià)值。