劉發(fā)全 明文慶 宋亞偉 丁在亮 吳昊

摘要?[目的]建立高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定飼料中乙氧酰胺苯甲酯含量。[方法]飼料中乙氧酰胺苯甲酯經(jīng)甲醇超聲提取，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱分離，以乙腈-水溶液（25∶75）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為306 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為350 nm，進(jìn)樣量20 μL。采用熒光檢測(cè)器（FLD）檢測(cè)，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]乙氧酰胺苯甲酯分離度良好，在0.192～9.661 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率在93.5%（n=6），RSD為0.22%，定量限為2.0 mg/kg，檢測(cè)限為1.0 mg/kg。[結(jié)論]該方法靈敏高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，適用于飼料中乙氧酰胺苯甲酯的含量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞?飼料;高效液相色譜-熒光檢測(cè)法;乙氧酰胺苯甲酯;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)?S?816.17文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0222-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.064

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Ethopabate Content in Feed by High Performance Liquid Chromatography?fluorescence Detection

LIU Fa?quan，MING Wen?qing，SONG Ya?wei et al

（Anhui Veterinary Drug and Feed Inspection Institute，Hefei，Anhui 230091）

Abstract?[Objective]The method was established to determine the content of ethopabate by high performance liquid chromatography?fluorescence detection.[Method]The methanol was used to extract ethopabate from feed.The samples were separated by ZORBAX Eclipse XDB?C18 （ 4.6 mm×150 mm，5 μm），using acetonitrile aqueous solution（25∶75） as mobile phases with flow rate 1.0 mL/min， detected by fluorescence exciting wavelength of 306 nm ，by emission wavelength of 350 nm， injected with 20 μL volume. The samples were detected by fluorescence detector （FLD） ， detected by external standard method.[Result]The ethopabate had good resolution，and had a good linear relationship with the peak area from 0.192 to 9.661 μg/mL. The average recovery was 93.5%（n=6），RSD was 0.22%， the quantitative limit was 2.0 mg/kg，the detection limit was 1.0 mg/kg.[Conclusion]The method is sensitive， reproducible and easy to operate， and is suitable for detecting the content of ethopabate in feed.

Key words?Feed;High performance liquid chromatography?fluorescence detection method;Ethopabate;Content determination

乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate），又名衣索巴，俗名球蟲酯，添加在飼料中用于預(yù)防和治療球蟲病的藥物，通過阻斷四氫葉酸的合成阻止裂殖體的正常發(fā)育而發(fā)揮作用，對(duì)巨型、布氏艾美爾球蟲以及其他小腸球蟲具有較好的抗蟲活性[1]，《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告）將乙氧酰胺苯甲酯列為可在飼料中添加使用的抗球蟲藥物添加劑，通常與尼卡巴嗪、鹽酸氨丙啉、磺胺喹噁啉合用增強(qiáng)抗球蟲效果，并規(guī)定蛋雞在產(chǎn)蛋期禁用，休藥期為3 d。《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告）規(guī)定乙氧酰胺苯甲酯在禽組織中的最高殘留限量分別為肌肉500 μg/kg、肝和腎1 500 μg/kg，在雞體內(nèi)不發(fā)生代謝，以藥物原型排出。

目前，乙氧酰胺苯甲酯檢測(cè)方法有紫外分光光度法[2]、薄層層析法[3]、電化學(xué)傳感器法[4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、高效液相色譜法[6]等。乙氧酰胺苯甲酯原料與制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)獸藥典》2015年版（一部）[7]，采用高效液相色譜紫外法測(cè)定含量，動(dòng)物源食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留采用高效液相色譜紫外法[8]，目前尚未建立飼料中乙氧酰胺苯甲酯含量檢測(cè)方法，為了準(zhǔn)確測(cè)定含量，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，研究高效液相色譜-熒光法測(cè)定飼料中乙氧酰胺苯甲酯含量，以期為建立飼料中乙氧酰胺苯甲酯檢測(cè)方法提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1

主要儀器。Agilent1260高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器（FLD）、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司;賽多利斯CPA225D十萬(wàn)分之一電子天平;KS-500EI超聲波清洗機(jī)，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.1.2

主要試劑。乙氧酰胺苯甲酯對(duì)照品（批號(hào)：H0010910，含量100.0%）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞復(fù)合預(yù)混合飼料;乙腈、甲醇均為色譜純，美國(guó)FISHER Chemical公司;水，水質(zhì)符合實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水的規(guī)定。

1.2?方法

1.2.1

對(duì)照品儲(chǔ)備液和對(duì)照品工作液的配制。精確稱取100.17 mg乙氧酰胺苯甲酯對(duì)照品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成對(duì)照品儲(chǔ)備溶液;分別精密量取0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液置于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋、定容，制成濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 μg/mL的對(duì)照品工作液。

1.2.2

供試品溶液的制備。選取有代表性的飼料樣品約500 g，四分法縮減至100 g，磨碎，全部通過0.42 mm孔徑分析篩，充分混勻，精確稱取飼料（雞配合飼料2 g、雞濃縮飼料0.4 g、雞復(fù)合預(yù)混合飼料0.1 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入25 mL甲醇，振搖混勻，超聲提取30 min后，以8 000 r/min離心10 min，取離心上清液用0.45 μm尼龍濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3

色譜分析條件。色譜柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水溶液（25∶75）;流速為1.0 mL/min;熒光激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）306 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Ea）350 nm;柱溫：室溫;進(jìn)樣量20 μL。

1.2.4?方法學(xué)考察。

1.2.4.1

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2?線性關(guān)系的考察。自動(dòng)進(jìn)樣器吸取“1.2.1”工作液20 μL注入HPLC，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.3?精密度試驗(yàn)。自動(dòng)進(jìn)樣器精密量取濃度為1.00 μg/mL的對(duì)照品工作液20 μL，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品工作液中乙氧酰胺苯甲酯峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.4

穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，在室溫下放置0、1、2、6、12、24 h后，按“1.2.3”色譜條件，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.4.5?重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)的樣品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件，進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)定樣品中乙氧酰胺苯甲酯的峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.6

加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取20 mg乙氧酰胺苯甲酯原料，逐級(jí)稀釋到2.5 kg飼料中，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)定峰面積和樣品中乙氧酰胺苯甲酯的含量，并計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.4.7

檢測(cè)限與定量限。采用空白飼料，乙氧酰胺苯甲酯添加量逐漸降低，樣品經(jīng)前處理和液相色譜分析后得到的添加回收率，實(shí)際測(cè)定得到的回收率和精密度能滿足方法回收率（80%～120%）和精密度（RSD≤10%）要求的最低濃度作為方法檢測(cè)限。

1.2.5

空白樣品的測(cè)定。取不含乙氧酰胺苯甲酯的飼料，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測(cè)定。

1.2.6

樣品測(cè)定。分別稱取肉雞配合飼料2 g、雞濃縮飼料0.4 g、產(chǎn)蛋雞預(yù)混料0.1 g各3份樣品，按“1.2.2”方法制備樣品，按“1.2.3”色譜條件注入HPLC，通過乙氧酰胺苯甲酯保留時(shí)間進(jìn)行定性，測(cè)定峰面積，外標(biāo)法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的含量。

2?結(jié)果與分析

2.1?方法學(xué)考察

2.1.1

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.2.3”色譜條件下，乙氧酰胺苯甲酯保留時(shí)間為12.1 min左右，對(duì)照品溶液色譜主峰保留時(shí)間與供試品保留時(shí)間一致，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于6 000。

2.1.2?線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出乙氧酰胺苯甲酯的線性回歸方程為Y=134.076 X-4.613（r=0.999 97），表明乙氧酰胺苯甲酯在0.192～9.661 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3?精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得出乙氧酰胺苯甲酯的峰面積RSD為0.65%（n=6），保留時(shí)間的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

2.1.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出試樣中乙氧酰胺苯甲酯的峰面積RSD為0.51%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.1.5?重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，測(cè)得樣品中乙氧酰胺苯甲酯的峰面積RSD為0.65%（n=6），保留時(shí)間的RSD小于1%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.6?加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，測(cè)得樣品中乙氧酰胺苯甲酯的含量、平均回收率和RSD，結(jié)果見表1，平均回收率為93.5%，RSD為0.22%，表明回收率較好，該方法符合要求。

2.1.7?檢測(cè)限與定量限。按“1.2.4.7”方法操作，結(jié)果表明1.0 mg/kg是能達(dá)到方法回收率和精密度要求的最低濃度。根據(jù)10個(gè)空白樣品的3倍平均信噪比對(duì)應(yīng)的乙氧酰胺苯甲酯含量進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，結(jié)果表明樣品中1.0 mg/kg添加濃度的回收率雖能達(dá)到回收率要求，但精密度高于方法精密度要求，所以該方法檢測(cè)限為1.0 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg。

2.2?空白樣品的測(cè)定?按“1.2.5”方法操作，結(jié)果見圖2，試驗(yàn)表明供試品基質(zhì)對(duì)待測(cè)物乙氧酰胺苯甲酯沒有干擾。

2.3?樣品測(cè)定

按“1.2.5”方法操作，測(cè)得肉雞配合飼料、雞濃縮飼料、產(chǎn)蛋雞預(yù)混料中乙氧酰胺苯甲酯平均含量分別為7.87、38.10、192.70 mg/kg。

3?討論

3.1?樣品的處理方法

該試驗(yàn)比較了采用超聲波與振蕩提取方法，選擇不同比例甲醇、乙腈水溶液提取飼料中乙氧酰胺苯甲酯的效率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用甲醇溶液超聲波提取方法回收率最高，飼料成分復(fù)雜，提取液雜質(zhì)較多，目標(biāo)物不易分離。有文獻(xiàn)報(bào)道[6，9]，采用固相萃取柱對(duì)試液進(jìn)行凈化，考慮到乙氧酰胺苯甲酯在飼料添加量在8 mg/kg左右，用固相萃取柱凈化回收率變化不大，因此采用甲醇超聲波提取離心后直接上機(jī)檢測(cè)，方法能夠減少雜質(zhì)干擾，降低成本，回收率穩(wěn)定。

3.2?熒光檢測(cè)條件的確定

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道液相色譜法測(cè)定乙氧酰胺苯甲酯的方法中[10]，采用270 nm紫外波長(zhǎng)測(cè)定，因雞配合飼料中乙氧酰胺苯甲酯含量較低，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度低，雜質(zhì)干擾比較嚴(yán)重，不能滿足檢測(cè)。該方法用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，將儀器激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為200 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍設(shè)定在210～800 nm，發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)在350 nm處有最大吸收，將350 nm波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)固定下來(lái);再做激發(fā)波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)在306 nm處有最大吸收。因此確定熒光檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)306 nm、發(fā)射波長(zhǎng)350 mm，相對(duì)于紫外檢測(cè)波長(zhǎng)提高了靈敏度2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，提高特異性，同時(shí)減少了雜質(zhì)干擾。

3.3?配伍藥物干擾因素

鹽酸氨丙啉、磺胺喹噁啉和尼卡巴嗪是與乙氧酰胺苯甲酯配伍使用的3種抗球蟲藥物[11]，分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，用乙腈溶解后，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示在該色譜條件下均未檢測(cè)出色譜峰，對(duì)乙氧酰胺苯甲酯檢測(cè)沒有干擾，表明該方法具有很強(qiáng)的專屬性。

4?結(jié)論

該研究建立了高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定飼料中乙氧酰胺苯甲酯含量的方法，通過試驗(yàn)，方法靈敏高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，適用于檢測(cè)飼料中乙氧酰胺苯甲酯的含量。

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