邱素艷，趙復(fù)生，Shih WeiChuan

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，南昌330200；2.中國(guó)科學(xué)院微電子研究所光電研發(fā)中心，北京100029；3.University of Houston,Department of Electrical and Computer Engineering,Houston,TX 77204,USA）

Au、Ag等金屬納米結(jié)構(gòu)中的自由電子在入射光的激發(fā)作用下易表現(xiàn)出集體振動(dòng)[1]，促使金屬周圍電場(chǎng)得到明顯增強(qiáng)，同時(shí)Au或Ag表面自由電子因集體振動(dòng)而離開原子核，從而引起表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR） 和局域表面等離子體共振效應(yīng) （Localized surface plasmon resonance，LSPR）[2-4].且表面共振強(qiáng)度和頻率與金屬納米結(jié)構(gòu)的尺寸和形態(tài)有著密切關(guān)系.而Au或Ag納米結(jié)構(gòu)表面結(jié)合一些分子時(shí)，在激光的激發(fā)下，它們的拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度由于其電子躍遷和分子振動(dòng)的耦合作用，也會(huì)極大地得到增強(qiáng)，這種現(xiàn)象通常稱為表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)（Surface enhanced Raman scattering，SERS）[5-8].

納米多孔金盤由于其獨(dú)特海綿狀結(jié)構(gòu)，且擁有大量韌帶、孔徑結(jié)構(gòu)和盤狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了高密度的等離子體共振熱點(diǎn)，進(jìn)而誘導(dǎo)納米多孔金盤周圍電場(chǎng)明顯增強(qiáng)，使其具有極強(qiáng)的等離子體共振效應(yīng)[9-11].因此，海綿狀納米多孔金盤（Spongy nanoporous disks，SNPD）是等離子體共振傳感器的理想選擇之一.基于SNPD的諸多優(yōu)勢(shì)，Shih課題組[12]設(shè)計(jì)了一種高靈敏SERS傳感器用于監(jiān)測(cè)DNA序列之間的雜交過程.他們將一端修飾有染料Cy3的發(fā)卡式DNA結(jié)合在SNPD表面.當(dāng)加入與頸環(huán)部分互補(bǔ)的目標(biāo)DNA時(shí)，其發(fā)卡式結(jié)構(gòu)展開，致使修飾Cy3的一端遠(yuǎn)離SNPD表面，使其SERS信號(hào)因距離的增加而逐漸減小，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)DNA雜交過程的目的.在理想狀態(tài)下，該方法能監(jiān)測(cè)到單個(gè)DNA序列的雜交.同時(shí)，該課題組還提出了一種表面增強(qiáng)熒光傳感技術(shù)用于識(shí)別癌癥生物條形碼，其靈敏度低至2.4 zeptomole[13].然而這些技術(shù)都建立在復(fù)雜的染料標(biāo)記基礎(chǔ)上，增加了該類技術(shù)的操作成本和繁瑣性.但上述研究結(jié)果仍然表明了SNPD具有優(yōu)異的表面等離子體共振效應(yīng)，為高靈敏識(shí)別DNA獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)提供了可能性.

端粒DNA主要由重復(fù)串聯(lián)的富G DNA序列折疊形成，例如（TTAGGG）n，易折疊成 G-四鏈體[14-16].G-四鏈體被認(rèn)為在哺乳動(dòng)物基因組中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制和基因組穩(wěn)定性等方面都起著至關(guān)重要的作用.然而目前很多識(shí)別G-四鏈體的方法局限在熒光技術(shù)方面[17-18].Bhasikuttan等基于G-四鏈體易與孔雀石綠分子形成復(fù)合物的特性，提出了一種簡(jiǎn)單的G-四鏈體熒光識(shí)別方法[19].由于G-四鏈體與孔雀石綠分子特有的相互作用并沒有在單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈 DNA（dsDNA）中發(fā)現(xiàn)，因此該方法能夠用于識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu).然而該方法的最低識(shí)別濃度為2.0 μmol/L，靈敏度不足.因此，本研究基于SNPD提出一種新的SERS傳感器，用于G-四鏈體的高靈敏識(shí)別，且無需經(jīng)過復(fù)雜的標(biāo)記過程.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 SNPD的制備

選取厚度為75 nm的Au/Ag合金薄膜為基底，采用勻速流動(dòng)注射器在其表面覆蓋一層聚苯乙烯納米顆粒（直徑為460 nm），形成單分子層.通過氧氣電漿對(duì)其表面進(jìn)行刻蝕2 min，其壓力和功率分別設(shè)置為4 Pa和100 W.然后將上述刻蝕好的Au/Ag合金薄膜置入氬氣電漿中繼續(xù)刻蝕12 min，其壓力和功率分別是0.27 Pa和100 W，刻蝕結(jié)束后將得到表面含有納米盤狀結(jié)構(gòu)的Au/Ag合金薄膜，將其置于氯仿溶液中超聲1 min，以除去表面殘留的聚苯乙烯納米顆粒.最后，將含有納米盤狀結(jié)構(gòu)的Au/Ag合金薄膜浸沒在70%左右的濃硝酸中1 min，以溶解合金薄膜中的Ag成分，形成多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)SNPD，采用二次水沖洗3次，以除去表面反應(yīng)產(chǎn)物和過多的硝酸.并采用鉆石刀將上述SNPD切割成大小為4 mm×5 mm備用.

1.2 G-四鏈體的識(shí)別

巰基功能化的端粒DNA （堿基序列為：5’-HS-（CH2）6-TTT TTT TTT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GG-3’）加入至10 mmol/L PBS緩沖液中（pH 為 7.38，且含有 50 mmol/L KCl），加熱至 90 °C，并保持10 min.然后慢慢冷卻至37°C，并培育1.0 h，形成G-四鏈體結(jié)構(gòu).隨后，將2.0 μL的10 mmol/L tris（2-carboxyethyl）phosphine（TCEP）加 入 至 上 述G-四鏈體溶液中，在室溫條件下保持1.0 h以活化巰基基團(tuán).接著將洗凈的4 mm×5 mm SNPD浸沒于上述溶液中，加入 MG（2.0 μmol/L）溶液，反應(yīng) 30 min后，形成G-四鏈體/MG復(fù)合物修飾的SNPD.最后，將上述修飾好的SNPD采用去離子水沖洗其表面，并轉(zhuǎn)移至0.3 mmol/L MCH溶液中3 h，用于除去MG分子的表面非特異性吸附.

1.3 拉曼測(cè)試

圖1 SNPD形貌示意Fig.1 SEM of SNPD and diagram of BT decorated

拉曼測(cè)試采用組裝的線性掃描拉曼顯微系統(tǒng)[20]，采用60X物鏡（NA=1.2），激光激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，激光聚焦在樣品上的線長(zhǎng)度為133 μm，寬度為1.0 μm.曝光時(shí)間為10 s.所有的SERS光譜都需基線校正[21].

2 結(jié)果與討論

2.1 SNPD表面形貌特征

采用SEM對(duì)SNPD的表面形貌進(jìn)行表征，如圖1所示.

從圖1中可以觀察到SNPD呈現(xiàn)半有序的盤狀結(jié)構(gòu)，且金盤尺寸大小均一，其直徑是360 nm左右（如圖1（a）），其直徑大小主要是由Au/Ag合金表面覆蓋的聚苯乙烯納米顆粒尺寸控制，且隨著聚苯乙烯納米顆粒尺寸的增大而增大.每個(gè)金盤均含有高密度的孔徑結(jié)構(gòu)和韌帶結(jié)構(gòu)，孔徑大小為15 nm左右，高度為75 nm左右（如圖1（b））.上述SNPD的半有序盤狀結(jié)構(gòu)，高密度孔徑結(jié)構(gòu)和韌帶結(jié)構(gòu)均能為表面增強(qiáng)拉曼散射提供大量增強(qiáng)熱點(diǎn)和比表面積，也為外來分子提供大量結(jié)合位點(diǎn).SNPD被認(rèn)為是一種較為理想的SERS傳感基底.

為了更好地計(jì)算SNPD的表面增強(qiáng)拉曼散射因子（Enhancement factor，EF），首先將結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的巰基苯（Benzenethiol,BT）組裝在SNPD表面，組裝時(shí)間為 30 min，形成單分子層（如圖 1（c）所示），然后依次采用乙醇和二次水清洗SNPD表面，以除去過多的BT，最后測(cè)試 BT 的 SERS 光譜（如圖 1（d）所示）.從圖1（d）中明顯觀察到單個(gè)SNPD表面上BT的拉曼

ISERS和Ineat分別為SNPD表面的SERS強(qiáng)度和正常拉曼強(qiáng)度；NSERS和Nneat分別為貢獻(xiàn)于SNPD表面SERS強(qiáng)度分子數(shù)和貢獻(xiàn)于正常拉曼強(qiáng)度的分子個(gè)數(shù).

2.2 G-四鏈體SERS傳感原理

將上述所制備的SNPD作為SERS傳感基底，用于G-四鏈體的高靈敏檢測(cè)，其構(gòu)建示意圖如圖2所示.首先巰基修飾的富G端粒酶DNA序列固定在SNPD表面，隨著K+的加入，該富G DNA序列將折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，其能與MG分子產(chǎn)生π-π共軛作用和靜電作用，從而將MG分子捕獲到SNPD表面，因此在SNPD表面大量共振熱點(diǎn)的增強(qiáng)作用下，MG分子能產(chǎn)生強(qiáng)SERS信號(hào).為了減小MG分子的表面非特異性吸附的影響，將MCH分子加入至該傳感體系，其能通過Au-S鍵結(jié)合在SNPD表面，占據(jù)MG分子的表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以達(dá)到除去非特異性吸附的目的.

圖2 基于SNPD的G-四鏈體SERS傳感技術(shù)示意Fig.2 Scheme of the SERS sensing for G-quadruplexes detection based on SNPD

2.3 G-四鏈體與MG之間的相互作用

SNPD表面的消光光譜被測(cè)試用于研究其表面修飾狀態(tài)及G-四鏈體與MG之間的相互作用.從圖3中可以看出，當(dāng)SNPD浸沒在G-四鏈體/MG混合溶液中后，其表面吸收波長(zhǎng)發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象，從825 nm紅移至858 nm，紅移波長(zhǎng)為32 nm，且在632 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的較為明顯的吸收峰（如圖 3（b））.且該波長(zhǎng)與 MG 的吸收波長(zhǎng)一致[22]，因此632 nm被歸屬于SNPD表面的MG分子吸收峰.上述結(jié)果表明G-四鏈體通過-SH與SNPD表面Au相互作用，被結(jié)合在了SNPD表面，同時(shí)MG也被成功光譜強(qiáng)度在1 075 cm-1處遠(yuǎn)大于其正常拉曼光譜強(qiáng)度.通過式（1）可計(jì)算出其在1 075 cm-1處的表面增強(qiáng)拉曼散射因子為7.4×108：捕獲至SNPD表面.但是由于MG結(jié)合在SNPD表面除了通過G-四鏈體的特異性捕獲外，可能還存在非特異性吸附.因此，本研究采用MCH分子除去非特異性吸附.將上述修飾有G-四鏈體和MG的SNPD轉(zhuǎn)移至MCH溶液中3 h后，632 nm處的吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著下降，并伴隨著另一個(gè)吸收峰從858 nm紅移至863 nm（如圖3（c））.導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因是MCH分子替換了原本結(jié)合在SNPD表面上的MG非特異性吸附位點(diǎn).因此，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了先前MG可能在SNPD表面存在非特異性的推測(cè)，但其能夠被MCH分子替換，從而能夠有效降低MG的非特異性吸附.

2.4 選擇性

圖4顯示了不同DNA修飾SNPD浸沒在MG溶液后，其表面SERS信號(hào)的變化.如圖4所示，當(dāng)ssDNA修飾SNPD和dsDNA修飾SNPD浸沒在MG溶液時(shí)，僅在1 100 cm-1處觀察到1個(gè)較強(qiáng)的SERS峰信號(hào)，該峰來自于MCH分子的Raman振動(dòng)峰，其余 SERS 峰信號(hào)均非常弱（如圖 4（a）和 4（b））.然而，當(dāng)G-四鏈體修飾SNPD浸沒在MG溶液時(shí)，除了在1 100 cm-1處觀察到MCH分子的SERS信號(hào)外，也能明顯觀察到其它的SERS信號(hào)，且信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于ssDNA修飾SNPD和dsDNA修飾SNPD（如圖4（c））.每個(gè)新出現(xiàn)的SERS信號(hào)歸屬如表1所列，發(fā)現(xiàn)其它的SERS信號(hào)均來自于SNPD表面捕獲的MG分子，且峰位置與文獻(xiàn)[23-26]報(bào)道一致.上述結(jié)果表明G-四鏈體能夠高效捕獲MG分子，而ssDNA與dsDNA對(duì)MG分子的捕獲能力較差.因此，這種SERS傳感體系能夠被拓展用于識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu).

2.5 靈敏度

通過考察不同G-四鏈體濃度的SERS信號(hào)變化來闡明該技術(shù)的靈敏度.如圖5所示，在100 pmol/L～100 nmol/L范圍內(nèi)，SERS信號(hào)強(qiáng)度隨著G-四鏈體濃度的增加而迅速增大，當(dāng)濃度大于100 nmol/L時(shí)，SERS強(qiáng)度呈現(xiàn)緩慢增加，并趨于平衡.這主要?dú)w因于隨著G-四鏈體濃度的增加，捕獲的MG分子數(shù)量越多，從而引起MG的SERS信號(hào)增大.當(dāng)SNPD表面G-四鏈體結(jié)合位點(diǎn)均被MG分子占據(jù)時(shí)，此時(shí)SERS信號(hào)最大，并保持平衡.以SERS信號(hào)高于噪音信號(hào)3倍為限（S/N＝3），發(fā)現(xiàn)該SERS傳感器能識(shí)別到最低G-四鏈體濃度為100 pmol/L，遠(yuǎn)低于其它相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的熒光方法[27-28]，表明該方法對(duì)G-四鏈體檢測(cè)顯示出高靈敏性.

圖3 SNPD在不同修飾階段的消光光譜Fig.3 Extinction spectra of NPG disks at different modification steps

表1 MG分子的SERS光譜中Raman位移及其強(qiáng)度和歸屬Table 1 The Raman shifts,relative intensity,and band assignments for the SERS spectra of MG

圖4 不同DNA修飾SNPD的SERS光譜（在此所有的DNA濃度均為1.0 μmol/L）Fig.4 SERS spectra of different DNA modified NPG disks

圖5 該傳感技術(shù)對(duì)不同G-四鏈體DNA濃度的識(shí)別Fig.5 Dependence of G-quadruplexes concentrations on the sensing system:the SERS spectra

3 結(jié) 論

1）基于Au/Ag合金薄膜制備了一種海綿狀多孔納米金盤材料.該納米金盤高度約為75 nm，直徑約為360 nm，其內(nèi)部孔徑大小約為15 nm.

2）將海綿狀多孔納米金盤作為SERS傳感基底，建立了一種高靈敏檢測(cè)G-四鏈體的SERS傳感器，其檢測(cè)限低至100 pmol/L，且具有良好的選擇性，能從ssDNA和dsDNA中識(shí)別出G-四鏈體結(jié)構(gòu).

3）引起上述SERS傳感技術(shù)高靈敏和高選擇性的原因主要?dú)w為兩方面：一是SNPD表面的高密度韌帶和孔徑結(jié)構(gòu)為SERS傳感器提供了大量共振增強(qiáng)熱點(diǎn)；二是G-四鏈體能夠高效捕獲MG分子至SNPD表面，而ssDNA和dsDNA并未發(fā)現(xiàn)明顯捕獲MG分子的能力.