智曉玉 李衛(wèi)威 王少偉 汪進良

肺癌，尤其是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），是腫瘤相關性死亡的最主要原因[1]。在傳統(tǒng)手術治療、鉑類為基礎的化療以及放療快速發(fā)展的背景下，NSCLC的治療效果仍不能達到理想狀態(tài)。目前，以吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）成為存在EGFR突變NSCLC患者的標準一線治療方案[2]，其客觀緩解率可達到70%左右甚至更高，但通常1年左右就會產(chǎn)生耐藥[3]。因此，亟待尋求新的治療方法以應對EGFR突變的NSCLC患者耐藥的發(fā)生。近年來，以程序性死亡受體1（programmed death-1, PD-1）及其配體（programmed death-1 ligand, PD-L1）抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）在肺癌治療中取得突破性進展，但既往研究[4-7]卻顯示其對EGFR突變患者的治療效果并不理想。這就說明，EGFR突變很可能通過影響腫瘤免疫微環(huán)境，而進一步影響PD-1/PD-L1抑制劑對腫瘤的殺傷效果。PD-L1表達率是評估PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的潛在因素，尤其是其高表達的患者可以從相關治療中獲益更多[8]。我們將進一步總結EGFR突變對PD-L1表達影響的基礎及臨床研究，并對其結果存在差異的原因進行簡單探討，希望可以對相關研究及PD-1/PD-L1抑制劑的臨床應用提供有效的建議及指導。

1 EGFR突變導致PD-L1表達上調(diào)相關研究

1.1 基礎研究 2014年，Azuma團隊[9]對14種人NSCLC細胞系（PC9、HCC827、NCI-H1975、QG56、1-87、 H1299、H2122、H322、H460、LK2、LK87、H23、A549、H157）進行流式細胞分析技術檢測發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的細胞系PD-L1表達明顯高于EGFR野生型細胞系（P=0.023），且EGFR突變型細胞系HCC827、PC-9、H1975可以檢測到EGFR高水平的磷酸化作用（表1）。為了探索EGFR通路對PD-L1表達的影響，研究者進一步對EGFR突變細胞系HCC827、PC-9應用厄洛替尼處理后發(fā)現(xiàn)其PD-L1表達下調(diào)以及EGFR磷酸化受到抑制，但對EGFR野生型細胞系A549、H1975應用厄洛替尼處理后并未影響其PD-L1的表達及EGFR磷酸化水平。該研究說明，EGFR突變可以導致人NSCLC細胞系PD-L1表達上調(diào)。

表 1 依據(jù)基因突變狀態(tài)和組織病理學分類的肺癌細胞系Tab 1 Lung cancer cell lines classified according to oncogene status and histology

Chen等[10]于2015年對人NSCLC細胞系A549、PC-9、HCC827、H1975、H1993以及Beas-2B細胞系進行的相關研究進行了報道。該研究主要由四部分組成：①研究者通過蛋白質(zhì)印跡法、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，EGFR突變NSCLC細胞系（PC-9、HCC827、H1975）PD-L1表達水平明顯高于EGFR野生型細胞系（A549、H1993）和Beas-2B細胞系；并進一步應用免疫組織化學染色法及流式細胞分析技術對H1975和A549細胞系PD-L1表達情況進行驗證，結果與之前一致。②研究者使用了EGF去激活EGFR野生型細胞系，研究發(fā)現(xiàn)隨著EGF激活劑量的升高（0 ng/mL-40 ng/mL）Beas-2B細胞系中p-EGFR和PD-L1蛋白表達也逐漸升高；隨后，研究者對該細胞系進行了轉染來促進不同強度的EGFR-19del以及EGFR-L858R表達，發(fā)現(xiàn)同樣可以導致p-EGFR和PD-L1表達水平的升高。③研究者發(fā)現(xiàn)吉非替尼可以逆轉EGF激活導致的p-EGFR以及PD-L1表達上調(diào)；可以逆轉Beas-2B-EGFR-L858R 細胞系PD-L1表達上調(diào)；可以降低PC-9、HCC827細胞系的PD-L1蛋白表達；吉非替尼不會使H1975細胞系p-EGFR以及PD-L1表達發(fā)生變化，但C0-1686（三代EGFR-TKI）可以使該細胞系PD-L1表達下調(diào)。④研究者進一步研究認為EGFR突變是通過p-ERK 1/2/p-c-jun信號通路而不是p-AKT/p-S6通路影響PD-L1的表達。該研究團隊進一步驗證了Azuma團隊的相關研究，不僅說明了EGFR突變可以導致人NSCLC細胞系PD-L1表達上調(diào)，并對EGFR影響PD-L1表達的通路機制進行了簡單探索。

隨后，Lin等[11]通過流式細胞分析技術發(fā)現(xiàn)EGFR突變細胞系（PC-9、HCC827、NCI-H1650）比EGFR野生型細胞系（NCI-H1299、NCI-H460、SPC-A1）PD-L1表達高。同樣，為了確定EGFR的激活可以誘導PD-L1表達，研究者應用了重組人EGF（100 ng/mL）刺激H460細胞系，24 h后在該細胞系中發(fā)現(xiàn)了升高的PD-L1 mRNA及蛋白質(zhì)。充分說明EGFR激活可導致PD-L1表達上調(diào)。研究者進一步對PC-9以及HCC827細胞系進行不同劑量吉非替尼培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)，其PD-L1表達水平下調(diào)并且呈劑量依賴型。對嚴重免疫缺陷小鼠移植PC-9細胞系后應用吉非替尼并與溶媒組進行對比，發(fā)現(xiàn)應用吉非替尼的小鼠PD-L1表達低于對照組。相較之前的研究，該研究進一步說明應用EGFR-TKIs可以降低小鼠體內(nèi)PC-9細胞系的PD-L1表達。

Ota研究團隊[12]在2015年通過RT-PCR及流式細胞分析技術對EGFR突變細胞系（HCC827、H1975、PC-9、11-18、H1650）及野生型細胞系（H322、A549、1-87、LK87、H23、H2122、H1437、H1573、H1944、H157、H596、H460、H1299）的PD-L1 mRNA以及PD-L1細胞膜蛋白表達進行檢測。發(fā)現(xiàn)EGFR突變型細胞系PD-L1 mRNA以及細胞膜蛋白表達均高于野生型。并且進一步發(fā)現(xiàn)，應用厄洛替尼可以使HCC827細胞系PD-L1 mRNA以及PD-L1細胞膜蛋白表達下調(diào)。

2016年Zhang等[13]同樣采用RT-PCR和蛋白印跡分析技術對NSCLC細胞株EGFR野生型（A549、H1299、SPC-A1）和突變型（PC-9、H1975、HCC827）細胞系進行研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變細胞系PD-L1表達高于野生型。但H1299與PC-9細胞系PD-L1表達相近，考慮與PC-9細胞系TP53缺失有關，并且已有研究[14]證實其與PD-L1表達水平具有相關性，這也就說明共突變的存在可以進一步影響PD-L1的表達水平。同時該研究團隊進一步發(fā)現(xiàn)，EGFR突變影響PD-L1表達的通路可能為IL-6/JAK/STAT3。

2019年Guo研究團隊[15]對人NSCLC細胞系H522、H661、HCC827、H1299、HCC2935、H1650、H1792、H1975進行蛋白印跡技術檢測發(fā)現(xiàn)，三種EGFR突變細胞系（HCC827、HCC2935、H1975）PD-L1表達水平高于EGFR野生型細胞系（H522、H661、H1792、H1299）。為了進一步探究EGFR突變對PD-L1表達的影響，研究者對H661細胞系進行轉染（e19del、e19del+T790M、L858R、L858R+T790M），發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉染的細胞系PD-L1表達高于EGFR野生型細胞系。該研究較其他研究進一步發(fā)現(xiàn)了EGFR突變細胞系較野生型細胞系IκBα及低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）升高。

在進行EGFR突變對PD-L1表達影響的基礎研究過程中，Abdelhamed團隊[16]、Lastwika團隊[17]的研究結果也顯示了EGFR突變可以上調(diào)PD-L1表達，并分別對相關影響通路AKT/STAT3以及AKT/mTOM進行了進一步的簡要探索。

1.2 臨床研究 見表2。Azuma團隊[9]在體外細胞系研究的基礎上進一步對164例NSCLC患者進行PD-L1表達檢測發(fā)現(xiàn)，EGFR突變患者PD-L1表達率明顯高于EGFR野生型（P＜0.001），且EGFR突變是導致PD-L1表達上調(diào)的獨立因素（OR=25.4, 95%CI: 2.9-47.9, P=0.027）。

D'incecco等[18]對125例晚期NSCLC患者進行PD-L1表達分析，其中包括56例EGFR突變、29例KRAS突變、10例ALK突變、30例EGFR/KRAS/ALK野生型。在進行分析的標本中，有78.4%的標本來自于原發(fā)病灶，13.6%的標本來自于轉移病灶。其中123例標本成功進行了PD-L1表達評估，中位表達水平為75。對29例三陰性患者標本進行評估后發(fā)現(xiàn)中位PD-L1表達水平是20，明顯低于EGFR突變120（P＜0.001）、ALK突變115（P=0.02）、KRAS突變55（P=0.06）。在EGFR突變標本中PD-L1陽性率較高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

Tang等[19]研究了170例晚期NSCLC患者的PD-L1過表達率是65.9%（112/170）。其中，99例患者存在EGFR突變。PD-L1過表達在EGFR突變患者與野生型患者中分別占71.9%（64/89）、57.1%（32/56）（P=0.067）。

Song等[20]對385例肺腺癌PD-L1表達情況進行研究。該研究中，腫瘤比例評分（tumor proportion score, TPS）≥5%視為表達陽性。該研究發(fā)現(xiàn)205例EGFR突變患者中，112例（54.6%）PD-L1表達陽性；180例EGFR野生型患者中74例（41.1%）表達陽性（P=0.008）。研究者進一步發(fā)現(xiàn)在385例患者中有24例存在基因突變共表達的情況，且共突變比單基因突變對PD-L1陽性表達的影響更大（P＜0.001）。205例EGFR突變患者中包括14例共突變患者，這就說明基因共突變存在也是可能影響研究結果的因素。

2 EGFR突變導致PD-L1表達下調(diào)的臨床研究

Huynh等[21]對261例肺腺癌進行PD-L1表達評估。該研究排除既往進行過新輔助化療的患者。包括54例EGFR突變患者，有5例TPS≥5%，49例TPS＜5%。該研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與PD-L1表達呈負相關（P＜0.001）。

Ji等[22]對100例原發(fā)性肺腺癌患者標本進行PD-L1表達情況檢測。已排除既往行新輔助化療或有過惡性腫瘤病史的患者。該研究將cut-off值設置為5%。60例EGFR突變患者中，42例PD-L1低表達，18例高表達；EGFR野生型患者中18例低表達，22例高表達。該研究發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的患者PD-L1表達降低（P=0.012）。

Inoue等[23]對654例NSCLC患者進行研究，包括腺癌430例（65.7%）、鱗癌179例（27.4%）、其他45例（6.9%）。其中EGFR突變患者132例（20.2%），PD-L1表達陽性25例（12.4%），陰性107例（23.6%）；EGFR野生型522例（79.8%），PD-L1表達陽性176例（87.6%），陰性346例（76.4%）。該研究同樣發(fā)現(xiàn)EGFR突變可以下調(diào)PD-L1表達（P=0.001）。

表 2 已發(fā)表NSCLC患者EGFR 突變狀態(tài)與PD-L1表達相關性的研究匯總Tab 2 Published report that have studied the relationship of EGFR mutation and PD-L1 expression in NSCLC

Dong等[24]對15項研究進行了匯總分析發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的患者PD-L1表達較低（OR=1.79, 95%CI: 1.10-2.93, P=0.02）。為了對該匯總分析結果進行驗證，研究者對腫瘤基因圖譜研究（The Cancer Genome Atlas, TCGA）中的237例肺腺癌患者進行反向蛋白質(zhì)陣列分析（reverse phase protein microarray, RPPA），發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的PD-L1表達蛋白要比EGFR野生型低（P=0.014）；并對通過全基因組測序（wholegenome sequencing, WGS）對廣東省肺癌研究所（Guangdong Lung Cancer Institute, GLCI）的mRNA情況進行分析，也顯示EGFR突變患者PD-L1表達低于EGFR野生型患者（P=0.044）。研究者進一步對GLCI 255例NSCLC患者分析發(fā)現(xiàn)，EGFR突變和PD-L1表達具有負相關性（P=0.014）。

2017年Takada研究團隊[25]檢測了499例原發(fā)NSCLC患者PD-L1表達情況，并采用了4種不同cut-off值進行評估。這些患者中排除新輔助治療以及既往頭頸部、食道鱗癌患者。EGFR突變在腺癌患者中檢測，其中有效標本為235例，包括112例（47.7%）突變型以及123例野生型（52.3%）。按照1%、5%、10%、50% cut-off值分別進行分類的情況下，EGFR突變肺腺癌患者的PD-L1表達均低于EGFR野生型患者。于2018年，該研究團隊[26]再次對441例原發(fā)肺腺癌PD-L1表達情況進行研究發(fā)現(xiàn)，EGFR野生型與PD-L1的陽性表達具有相關性（P＜0.000,1）。同時，該研究進一步發(fā)現(xiàn)EGFR不同位點的突變與PD-L1表達無明顯相關性（P=0.599,9），但PD-L1 TPS 5%-49%在EGFR 19del患者中明顯高于EGFR外顯子21 L858R突變（12.2% vs 2.6%）。

Li等[27]分析了21項研究的4,857例患者，1,435例存在EGFR突變的患者中608例（36.7%）存在PD-L1陽性表達；3,422例突變野生型患者中1,456例（44.1%）存在PD-L1陽性表達。PD-L1表達與EGFR野生型存在相關性（OR=0.68, 95%CI: 0.48-0.96, P=0.03）。

近期，Lee等[28]對1,000例手術切除NSCLC患者（腺癌785例，鱗癌188例，21例大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，4例類癌，2例小細胞肺癌）PD-L1表達情況進行了研究。在按照＜1%、1%-49%、≥50% cut-off值分別進行分類的情況下，發(fā)現(xiàn)肺腺癌中存在EGFR突變患者（424例）的PD-L1表達率明顯低于EGFR野生型患者（P＜0.000,1）。

3 EGFR突變導致PD-L1表達改變無統(tǒng)計學意義

2014年Yang等[29]對163例肺腺癌患者PD-L1表達情況進行研究。PD-L1 TPS≥5%視為表達陽性。結果顯示，PD-L1陽性表達率為39.9%（65/163），但其陽性表達水平與常見的肺腺癌突變基因EGFR（P=0.193）、KRAS（P=0.268）、BRAF（P=0.438）和ALK（P=0.564）均沒有相關性。2016年該團隊又對105例肺鱗癌患者PD-L1表達情況進行研究[30]。同樣，PD-L1 TPS≥5%視為表達陽性。PD-L1陽性表達率為56.2%（59/105），且陽性表達水平與突變基因EGFR（P=0.561）、KRAS（P=0.255）、BRAF（P=0.064）和ALK（N/A）均不具有相關性。

Zhang[31]對143例肺腺癌PD-L1表達情況進行分析。并排除既往行新輔助化療或有過惡性腫瘤病史的患者。76例EGFR突變患者中，37例PD-L1表達陽性，39例表達陰性，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.946）。

Cooper研究團隊[32]檢測了678例NSCLC患者PD-L1表達情況。其中包括腺癌276例、鱗癌271例、大細胞癌116例、混合3例、其他病理類型12例。腫瘤細胞TPS顯示≥50%或H-Score≥50考慮為PD-L1高表達。EGFR突變患者兩種分級方法中不同PD-L1表達情況患者的數(shù)量均相同。EGFR野生型且PD-L1 TPS＜50%的患者222例（93.7%），PD-L1 TPS≥50%的患者15例（6.3%）；EGFR突變型PD-L1 TPS＜50%的患者33例（100%），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.23）。

Kim[33]、Schmidt[34]、Gainor[35]、Ameratunga[36]等團隊，在相關研究的過程中也發(fā)現(xiàn)NSCLC患者PD-L1表達情況與EGFR基因狀態(tài)無明顯相關性。

4 研究結果不一致原因分析

在對既往相關研究進一步學習的過程中，我們不難發(fā)現(xiàn)，EGFR突變對PD-L1表達相關影響的研究結果存在不一致性，我們總結出以下幾點可能的原因：①大多數(shù)臨床研究為回顧性研究，存在選擇偏倚，且納入患者數(shù)量不同，有些研究納入患者數(shù)量較少。②在這些研究中，患者基線特征的異質(zhì)性也會影響研究的結果，比如患者不同地域的分布、病理分型及分期。有相關研究顯示，亞裔EGFR突變概率要高于非亞裔，在亞洲人群中EGFR突變在NSCLC中占39.6%，在肺腺癌中更是高達50%[37]；鱗癌與腺癌基因突變的概率與種類不同[38]；PD-L1陽性表達在鱗癌NSCLC中比腺癌更常見[39,40]。③免疫治療領域目前缺乏關于PD-L1標準化測試，許多不同的評分標準與試劑被應用[41]。有研究[42]發(fā)現(xiàn)對同一標本應用不同抗體PD-L1蛋白表達結果不同；另外有研究發(fā)現(xiàn)，應用SP142染色的PD-L1表達陽性率低于其他抗體，如：28-8、22C3和SP263[43]。④PD-L1陽性表達的臨界值不同。⑤依據(jù)既往研究傳統(tǒng)化療[44]、抗血管治療[45-47]、EGFR-TKIs[10,11]均會對PD-L1表達有影響，本文提及的臨床研究部分未明確描述進行PD-L1檢測前既往治療情況。

5 總結與展望

隨著PD-1/PD-L1抑制劑治療NSCLC相關研究的不斷進展，腫瘤突變驅動基因對其治療療效的影響隨之被關注。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的復雜環(huán)境，腫瘤細胞PD-L1表達情況與PD-1/PD-L1免疫抑制劑治療效果存在一定相關性。因此，EGFR通路對PD-L1表達的影響也被進一步探索。雖然目前相關研究結果存在差異，但我們期待在未來研究的過程中可以對EGFR突變影響PD-L1表達水平的多條信號通路進行探索，并完成多中心、隨機性、前瞻性的臨床研究。希望在進一步的探索過程中，可以為EGFR突變患者找到提高PD-1/PD-L1抑制劑治療療效的突破點。