黃水仙 許熠銘 朱瑾 謝民強(qiáng) 李勇 管明 伏曉

隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的基因治療在臨床得到廣泛應(yīng)用?；蛑委煹脑硎遣捎没蜣D(zhuǎn)移技術(shù)將正常目的基因?qū)氚屑?xì)胞，使其表達(dá)特定的蛋白質(zhì)。磁性納米顆?？蓪⒒蛑委煼肿訑y入細(xì)胞并釋放，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療作用，并可縮短轉(zhuǎn)染時間、提高轉(zhuǎn)染效率，而且磁性納米載體有被動靶向、磁靶向和分子靶向等靶向性能，在腫瘤靶向治療方面有一定優(yōu)勢。本研究將MMP-2-ASODN與醛基化海藻酸鈉（ALG）改性的葉酸靶向磁性納米載體耦聯(lián)，制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物。然后以喉癌Hep-2細(xì)胞株及其BALB/c裸鼠皮下移植瘤作為相應(yīng)模型，采用透射電鏡、普魯士藍(lán)鐵染色及MRI成像技術(shù)檢測MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物對喉癌細(xì)胞的體內(nèi)、外靶向性，為后續(xù)喉癌基因靶向治療打下前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

1主要藥物、試劑與儀器

葉酸（美國Sigma公司），ALG（山東青島水產(chǎn)有限公司）。RCT bssic磁力攪拌器（德國IKA公司），DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀（上海雷磁新涇儀器公司），日本電子株式會社提供的透射電子顯微鏡（型號JEM-100CX II），美國Varian公司提供的石墨爐（型號GFA-Ex7i）及鐵空心陰極燈，美國GE公司提供的超導(dǎo)型雙梯度磁共振成像儀（型號GE 1.5 T），1英寸手指線圈。人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫），BALB/c裸鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物的制備

2.1.1 MMP-2-ASODN的設(shè)計(jì)和合成

利用Primer5.0軟件，根據(jù)人MMP-2基因cDNA序列設(shè)計(jì)與啟動子互補(bǔ)的反義寡核苷酸序列（antisenes oligodeoxynucleotide，ASODN），經(jīng) Genbank 同源性檢測證實(shí)該ASODN僅與MMP-2基因相應(yīng)位點(diǎn)匹配，與其它人類基因無匹配。同時設(shè)計(jì)與其堿基組成相同，但堿基順序隨機(jī)排列的無義寡核苷酸序列（nonsense oligodeoxynucleotide，NSODN）作為對照，經(jīng)Genbank檢測與任何已知人類基因無匹配。ASODN和無義寡核苷酸序列的堿基采用硫代修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性，5’端用氨基修飾以便下面實(shí)驗(yàn)連接磁性納米粒子。反義寡核苷酸和無義寡核苷酸均由上海生工公司合成，雙蒸水稀釋至100μmol·L-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

寡核苷酸序列如下：

MMP-2 ASODN：5'-CAC ACC TTG CCA TCG-3'

MMP-2 NSODN：5'-CGT CCC TAT ACG ACC-3'

2.1.2 制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物

我們課題組前期已成功制備了醛基化ALG修飾的磁性納米粒子，流體力學(xué)直徑為48.7±1.7nm，Zeta電位：-66.43±1.22mv，磁核平均粒徑8.116±0.24nm，其最大飽和磁化強(qiáng)度為56.2emu·g-1，矯頑力為零，其磁強(qiáng)度及超順磁性均較好。根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法[1，2]合成 NH2-PEG-FA。取 100μL 醛基化ALG修飾的磁性納米顆粒，然后加入30μL葉酸修飾的氨基聚乙二醇溶液（12mg·300μL-1） 和 20μL 100μmol·L-1的 Hpa AS-ODN，渦旋均勻后，于 4℃條件下避光反應(yīng)24小時。然后再加入一定量的硼氫化鈉溶液，使體系中硼氫化鈉的濃度為0.5mol·L-1。

2.2 葉酸含量的測定

葉酸分子包含高度共軌的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在365nm處存在特征性的強(qiáng)吸收峰，因此利用這個特點(diǎn)可采用紫外分光光度計(jì)測量樣品中的葉酸含量[2]。

2.3 納米復(fù)合物體外靶向性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞鐵染色

選取培養(yǎng)較好的兩組Hep-2細(xì)胞，其中一組預(yù)先葉酸封閉，經(jīng)消化離心后將其制成單細(xì)胞懸液（采用無葉酸RPMI-1640全培養(yǎng)基），調(diào)整其濃度至2×104個·ml-1后分別接種于 24 孔板內(nèi)，500μl/孔。貼壁培養(yǎng)24h，每株細(xì)胞各取6孔加入50ul葉酸PBS溶液（孔內(nèi)游離葉酸終濃度1mmol·L-1），作用30分鐘。加入無葉酸RPMI-1640稀釋的納米藥物培養(yǎng)2h，按鐵含量計(jì)藥物終濃度依次為0，2.5，5，10，20μg·ml-1。使用 PBS 液充分洗滌殘留藥物粒子，4%多聚甲醛溶液室溫下固定10分鐘。采用普魯士藍(lán)液染色，室溫靜置30min并避光，使用雙蒸水洗滌后采用中性紅染液復(fù)染。倒置顯微鏡下觀察。

2.3.2 透射電鏡觀察

選取培養(yǎng)較好的兩組Hep-2細(xì)胞，其中一組預(yù)先葉酸封閉，經(jīng)消化離心后將其制成單細(xì)胞懸液（采用無葉酸RPMI-1640全培養(yǎng)基），調(diào)整其濃度至5×104個·ml-1分別接種于 6 孔板內(nèi)，2ml/孔；貼壁培養(yǎng)24h后，加入無葉酸RPMI-1640稀釋的納米藥物培養(yǎng)2h，按鐵含量計(jì)藥物終濃度依次為0、2.5、5、10、20μg·ml-1；使用 PBS 液充分洗滌殘留藥物粒子；將胰蛋白酶加入各孔并在消化后制成單細(xì)胞懸液，1500rpm離心5分鐘后收集底部沉淀的細(xì)胞塊，向其中加入2.5%戊二醛下固定（溫度4℃）；低速離心除去固定液并用1%餓酸固定，采用梯度丙酮進(jìn)行脫水，使用環(huán)氧樹脂包埋。取超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，觀察細(xì)胞吞噬納米藥物在透射電鏡下的情況（中山大學(xué)北校區(qū)電鏡室）。

2.4 MRI觀察裸鼠移植瘤內(nèi)納米復(fù)合物的分布

2.4.1 喉癌移植瘤動物模型的建立

選取5周齡BALB/c裸鼠6只，在SPF環(huán)境下（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物實(shí)驗(yàn)部，場地合格許可證號SYXK粵2007-0081）經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將對數(shù)生長期的人喉癌Hep-2細(xì)胞以5×107個·ml-1的密度分別接種于裸鼠腋后背部皮下，每只接種0.2ml。

2.4.2 MRI及透射電鏡觀察納米復(fù)合物在裸鼠移植瘤內(nèi)的分布

接種Hep-2細(xì)胞的裸鼠移植瘤長至直徑10mm左右后進(jìn)行MRI觀察。裸鼠以1%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉以減少成像過程中的肢體活動。首先進(jìn)行MR T2加權(quán)成像（T2 W1），然后經(jīng)尾經(jīng)脈注射葉酸修飾的納米藥物0.2ml，繼續(xù)飼養(yǎng)2小時后再次行MR成像。

MRI采用Philips Quasar Dual 3.0T MR Achieva磁共振儀完成，選擇頭部線圈，成像系數(shù)TR/TE 1900/62ms，矩陣 512×512，F(xiàn)OV115mm，層厚 1mm，層距0.5mm。

MRI檢查結(jié)束后裸鼠脫頸處死，迅速取出瘤塊，1%餓酸固定，采用梯度丙酮進(jìn)行脫水，使用環(huán)氧樹脂包埋。取超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，觀察細(xì)胞吞噬納米藥物在透射電鏡下的情況（中山大學(xué)北校區(qū)電鏡室）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 葉酸含量的測定結(jié)果

以葉酸含量濃度（μg·ml-1）為縱坐標(biāo)，吸光度（OD值）為橫坐標(biāo)，繪制葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。其回歸方程式為y（葉酸含量）=112.08x-0.3832，R2=0.9996。根據(jù)樣品OD值用回歸方程式計(jì)算其葉酸含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，計(jì)算均值為 930.5±8.57μg·ml-1。

圖1 葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 納米復(fù)合物體外靶向性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鐵染色結(jié)果

鐵染色結(jié)果顯示，納米復(fù)合物與Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)2h后，大量的納米顆粒被Hep-2細(xì)胞胞漿吞噬（圖片上顯示為藍(lán)色顆粒），并且納米復(fù)合物濃度越高，被吞噬的顆粒越多（見圖2a、b）。而在預(yù)先給予葉酸封閉后，Hep-2細(xì)胞吞噬的納米顆粒較相同濃度下未封閉時明顯減少（圖2c、d）。

圖2a、2b 鐵染色結(jié)果顯示Hep-2細(xì)胞胞漿內(nèi)吞噬了大量的納米顆粒（藍(lán)色顆粒），并且隨著納米藥物濃度增加，吞噬的顆粒越多（圖 2a、b，400×）。圖2c、2d 鐵染色結(jié)果顯示預(yù)先給予葉酸封閉后，Hep-2細(xì)胞吞噬的納米顆粒較相同濃度下未封閉時明顯減少（圖2c、d，200×）。

2.2 透射電鏡觀察

兩組Hep-2細(xì)胞與納米復(fù)合物共培養(yǎng)2小時后進(jìn)行透射電鏡檢測，結(jié)果見未經(jīng)葉酸封閉處理的Hep-2細(xì)胞吞噬大量高電子密度的納米顆粒，成團(tuán)散布在細(xì)胞胞漿內(nèi)（圖3箭頭表示）。而經(jīng)葉酸封閉處理的Hep-2細(xì)胞僅吞噬少量高電子密度的納米顆粒。

2.3 荷瘤裸鼠的MR成像結(jié)果

BALB/c裸鼠皮下種植Hep-2細(xì)胞成瘤后，在經(jīng)尾靜脈注射葉酸靶向磁性納米復(fù)合物前和注射24小時后進(jìn)行MRI成像，結(jié)果如圖4所示，注射后瘤區(qū)T2信號顯著降低。

圖3 透射電鏡照片（11.5千倍）

圖4 荷瘤裸鼠的MRI成像結(jié)果（左為注射納米藥物前，右為注射后）

2.4 裸鼠移植瘤透射電鏡檢查結(jié)果

檢查結(jié)果顯示大量高電子密度的納米顆粒被部分腫瘤細(xì)胞吞噬，并成團(tuán)分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)；另有少量納米顆粒存于細(xì)胞間隙（圖5箭頭表示）。

圖5 透射電鏡照片（15.5千倍）

討論

基因治療的原理是采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將正常目的基因?qū)氚屑?xì)胞，使其表達(dá)特定的蛋白質(zhì)。其中，ASODN技術(shù)是指利用人工合成的與DNA或mRNA某一區(qū)段互補(bǔ)的ASODN片斷，通過堿基互補(bǔ)原則結(jié)合于目的基因上，從而封閉基因的表達(dá)，起到基因治療的作用[3]。然而寡核苷酸因其自身負(fù)電荷導(dǎo)致較難穿過細(xì)胞膜，且易被核酸酶降解[4，5]，因此ASODN需要一個基因載體來維護(hù)并提高其轉(zhuǎn)染效率。目前常用的基因載體主要有病毒、非病毒載體[5，6]。病毒載體主要有慢病毒、腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒等。病毒轉(zhuǎn)染效率較高，但仍存有不足之處：病毒載體制備復(fù)雜；具有免疫原性及細(xì)胞毒性；攜帶DNA量少（4.5～30kbp）；其宿主范圍較為廣泛，同時組織細(xì)胞特異性也較為缺乏；潛在的致瘤性會導(dǎo)致在重組過程中產(chǎn)生病毒感染[7]。非病毒載體目前應(yīng)用最多的是脂質(zhì)體，但是脂質(zhì)體容易被細(xì)胞內(nèi)外的水解酶消化、轉(zhuǎn)染效率不高、組織特異性缺乏、有一定細(xì)胞毒性等[8]。不論是病毒載體還是脂質(zhì)體，它們在腫瘤基因治療中靶向性均不良，而基因載體在靶部位聚集較慢、靶部位載體濃度過低是導(dǎo)致基因傳輸及表達(dá)效率不高的主要原因[9]。

磁性納米顆粒是一種新型非病毒基因載體，在腫瘤靶向治療方面有一定優(yōu)勢。研究表明在細(xì)胞的吞噬作用下直徑在100nm以下的磁性納米顆?？蓴y帶基因治療分子進(jìn)入細(xì)胞并釋放，其靶向性基因治療安全有效[10]。磁性納米顆粒對腫瘤的靶向性主要有分子靶向、磁靶向、被動靶向。腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不整齊且間隙較大、缺乏有效的淋巴引流系統(tǒng)形成被動靶向，納米顆粒通過滲透增強(qiáng)和截留作用（enhanced permeability and retention effect，EPRE)更容易沉積在腫瘤組織中[11，12]。通過在外磁場的引導(dǎo)下使磁性納米顆粒逐漸定向于腫瘤為磁靶向機(jī)制，使與磁性納米藥物搭載的治療基因在腫瘤區(qū)域定位并集中釋放，達(dá)到低毒、高效治療的效果。研究表明，采用磁性納米藥物作為基因載體轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞或組織器官，可降低轉(zhuǎn)染時間，轉(zhuǎn)染率隨之升高[13]。分子靶向是通過在納米藥物表面修飾針對腫瘤細(xì)胞特異靶點(diǎn)的配體（例如單克隆抗體或某些小分子），通過配體-受體的特異性結(jié)合使得納米藥物被腫瘤細(xì)胞攝取吞噬，從而達(dá)到靶向治療的目的。此外，磁性納米載體還具有無免疫原性、無遺傳毒性與細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)。

文獻(xiàn)顯示葉酸受體在正常組織中很少表達(dá)，而在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，是一種腫瘤相關(guān)抗原[14，15]。我們前面的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了葉酸受體在喉癌中高度表達(dá)。因此，我們在本實(shí)驗(yàn)中采用葉酸受體作為磁性納米復(fù)合物主動靶向的靶點(diǎn)，通過在磁性納米載體表面修飾葉酸，制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物。我們制備的納米復(fù)合物粒徑較小、含有親水的改性表層，可有效的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，延長其體內(nèi)循環(huán)時間，增加磁性納米復(fù)合物的靶向效率。因此，這種葉酸靶向磁性納米粒作為基因載體具有良好的穩(wěn)定性和靶向性。

由于本納米復(fù)合物以Fe3O4作為核心，因此實(shí)驗(yàn)中我們采用鐵染色、MRI、透射電鏡等容易顯示鐵粒子的方法來檢測該葉酸靶向磁性納米復(fù)合物的分子靶向性能。鐵染色的原理是Fe3+在酸性條件下與亞鐵氰化鉀通過普魯士藍(lán)反應(yīng)生成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，可反映組織細(xì)胞內(nèi)攝取的氧化鐵納米粒子的情況[16，17]。我們將不同濃度的葉酸靶向納米復(fù)合物與Hep-2細(xì)胞共培養(yǎng)2h后進(jìn)行鐵染色檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞內(nèi)吞噬了大量的納米顆粒，其吞噬數(shù)量與藥物濃度正相關(guān)，而預(yù)先給予葉酸封閉的Hep-2細(xì)胞同樣吞噬了部分納米顆粒，但是較之相同濃度下未封閉的Hep-2細(xì)胞顯著減少。這說明葉酸靶向納米復(fù)合物是通過葉酸受體途徑的分子主動靶向作用，可以顯著增加喉癌Hep-2細(xì)胞對納米復(fù)合物的吞噬。透射電鏡的觀察也可明顯看到Hep-2細(xì)胞對納米復(fù)合物的吞噬。核磁共振成像（MRI）通過計(jì)算機(jī)將生物體不同組織在外磁場的作用下產(chǎn)生的共振信號還原為圖像，能夠立體的顯示不同組織間的細(xì)小差別，是臨床早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的重要方法之一。超順磁性納米顆粒（superparamagnetic nanopatticles）是應(yīng)用于MRI的新一代磁性造影劑。其磁化強(qiáng)度隨磁矩值不同而改變，并且撤去外磁場后其磁化消失，其馳豫率（Relaxivity）顯著高于釓螯合物類造影劑[18，19]。我們制備的葉酸靶向磁性納米復(fù)合物具有超順磁性，因此可以作為MRI造影劑。通過MRI檢查可以發(fā)現(xiàn)注射后裸鼠移植瘤區(qū)域T2信號顯著降低，說明經(jīng)尾靜脈注射的葉酸靶向納米復(fù)合物具有良好的靶向性，同時具有MR陰性造影劑的效果，可以通過MRI檢查進(jìn)行藥物分布的檢測。

本研究成功制備了葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復(fù)合物，通過鐵染色、MRI、透射電鏡等檢查證實(shí)，該納米復(fù)合物對喉癌Hep-2細(xì)胞和裸鼠移植瘤具有良好的分子靶向性，為后續(xù)喉癌的基因治療奠定了基礎(chǔ)。